Фарм Микробиологи

Стандарты при выборе для дезинфектантов: что важно знать

2026-05-21T11:32:19.061Z

Рассмотрим действующие европейские стандарты в отношении дезинфицирующих средств (ДС) и ключевые моменты, которые необходимо учитывать для обеспечения биоцидной эффективности.

На рынке существует огромный выбор дезинфицирующих средств и химических агентов, нам важно сделать правильный выбор. А для этого важно понимать какую степень эффективности может нам подтвердить наличие ярлыка EN у производителя ДС.

Рассмотрим существующие европейские нормы (ЕN) в отношении дезинфицирующих средств.

Основная функция дезинфицирующего средства заключается в его способности убивать или инактивировать микроорганизмы. Производители дезинфицирующих средств предоставляют данные об эффективности, относящиеся к двум ключевым критериям: времени контакта и требуемой концентрации. Эти данные должны основываться на испытаниях продукта. В Европе это означает тестирование в соответствии с европейскими нормами (ЕN).

Все стандарты EN принимаются одной из трех признанных европейских организаций по стандартизации (ESO): CEN, CENELEC или ETSI.

Европейские стандарты для испытаний дезинфицирующих средств основаны на методах, ориентированных на практическое использование. Теоретически, эти стандарты должны позволять проводить прямое сравнение дезинфицирующих средств разных производителей.

Ключевое слово здесь — «должны». Эти стандарты регулярно пересматриваются и обновляются, но для производителя дезинфицирующих средств не является обязательным проводить испытания в соответствии с последней версией стандарта. Например, стандарт EN13624:2003: версия 2003 года была заменена стандартом EN13624:2013, который устанавливает более строгие требования к испытаниям на эффективность ДС. На практике это означает, что дезинфицирующее средство, протестированное по стандарту EN 2013, должно использоваться в более высокой концентрации и/или с более длительным временем контакта, чем если бы оно было протестировано по стандарту 2003 года.

В настоящее время существует ряд европейских стандартов EN, которые проверяют способность дезинфицирующего средства уничтожать микроорганизмы в жидкой суспензии, так и методы испытаний, которые проверяют способность дезинфицирующего средства уничтожать микроорганизмы, высушенные на поверхности.

Ключевые моменты при выборе стандартов испытаний, используемых производителем, включают:

• Нейтрализация дезинфицирующего средства

• Уровень загрязнения. Для моделирования загрязнения используют различные подходы, часто с применением белков, чтобы максимально точно имитировать условия эксплуатации.

• Выбор тестовых организмов. Например, тестирование только на вегетативные бактерии, или тестирование на спороцидное действие.

• Время контакта

• Критерии соответствия. Большинство стандартов EN требуют снижения концентрации микроорганизмов на 5 порядков или более, но некоторые стандарты имеют более низкие критерии соответствия.

Следует обращать внимание на методы стандартов тестирования. Например, суспензионный тест (EN 13727:2012) не является убедительным доказательством активности дезинфицирующего средства против бактерий, высушенных на поверхностях; вместо этого следует использовать тест EN 13697:2023.

Список европейских стандартов в отношении дезинфицирующих средств:

EN 14885:2022 «Химические дезинфицирующие средства и антисептики — Применение европейских стандартов к химическим дезинфицирующим средствам и антисептикам»

EN 13624:2021 «Химические дезинфицирующие средства и антисептики. Количественный суспензионный тест для оценки фунгицидной или дрожжецидной активности в медицинской области. Метод испытания и требования (фаза 2, шаг 1)».

EN 13697:2023 «Химические дезинфицирующие средства и антисептики - Количественный тест на непористых поверхностях для оценки бактерицидной, дрожжецидной и/или фунгицидной активности химических дезинфицирующих средств, используемых в пищевой, промышленной, бытовой и общественной сферах без механического воздействия - Метод и требования к тестированию без механического воздействия (фаза 2, шаг 2)»

EN 13727:2012+A2:2015 «Химические дезинфицирующие средства и антисептики. Количественный суспензионный тест для оценки бактерицидной активности в медицинской области. Метод испытания и требования (фаза 2, шаг 1)».

EN 14476:2025 «Химические дезинфицирующие средства и антисептики. Количественный суспензионный тест для оценки вирулицидной активности в медицинской области — метод испытания и требования (фаза 2/шаг 1)».

EN 17126:2018 «Химические дезинфицирующие средства и антисептики. Количественный суспензионный тест для оценки спороцидной активности химических дезинфицирующих средств в медицинской области. Метод испытания и требования (фаза 2, шаг 1)».

EN 16615:2026 «Химические дезинфицирующие средства и антисептики - Количественный метод оценки бактерицидной, дрожжециднлй и/или фунгицидной и/или туберкулоцидной и/или микобактерицидной активности на непористых поверхностях с механическим воздействием с помощью салфеток или швабр в медицинской зоне - Метод и требования к тестированию (фаза 2, шаг 2)».

Данные европейские стандарты применяются к дезинфицирующим средствам, используемым в пищевой промышленности, медицинской сфере в области гигиенической обработки рук, гигиенического мытья рук, хирургической обработки рук, хирургического мытья рук, дезинфекции инструментов погружением и дезинфекции поверхностей протиранием, распылением, или другими способами.

Основное требование — снижение количества вегетативных микробных клеток не менее чем на 5 порядков в соответствии с EN 13624 и EN 13727 и снижение количества бактериальных спор на 4 порядка в соответствии с EN 17126.

Существуют так же стандарты EN 1276:2019, EN 1650:2019, EN 13704:2018 но прямого отношения к медицинской сфере они не имеют ("используется в пищевой, промышленной, бытовой и общественной сферах").

Пример данных о проверки эффективности в соответствии с европейскими стандартами средства Contec ProChlor

Суспензионный тест для оценки эффективности дезинфицирующего средства

Цель количественного суспензионного теста, как указано в вышеуказанных стандартах, состоит в оценке активности данного дезинфицирующего средства против ряда микроорганизмов в условиях, максимально приближенных к практическому применению.

Тест заключается в инокуляции тестируемого дезинфицирующего средства в «чистых» и «загрязненных» условиях суспензией тестируемого микроорганизма.² После определенного времени контакта отбирается аликвота, и добавляется нейтрализатор.

После этапа нейтрализации определяется количество выживших микроорганизмов в каждом образце, и рассчитывается снижение количества жизнеспособных микроорганизмов.

Для суспензионных испытаний оценивается определенная концентрация и время контакта. Кроме того, дезинфицирующее средство приготавливается по «наихудшему случаю» с использованием «воды стандартной жесткости» (которая содержит ионы, такие как магний и кальций, а также другие соли). Дополнительное условие — имитация «загрязнения» («загрязненные» условия), которая достигается добавлением бычьего сывороточного альбумина (0,03%, что соответствует «чистым» условиям, и 0,3%, что соответствует «грязным» условиям).⁴

Для демонстрации эффективности дезинфицирующего средства его необходимо протестировать с использованием панели микроорганизмов. Соответствующие микроорганизмы перечислены в стандартах, по стандарту EN 17126:2018 при выборе панели микроорганизмов следует учитывать биоцидную активность дезинфицирующего средства (в клинической практике подходящей бактерией является Clostridium difficile). Это означает, что стандарт EN 17126:2018 применяется только к дезинфицирующим средствам, обозначенным как спороцидные.

Что касается выбранного дезинфицирующего средства, то двумя ключевыми переменными, которые необходимо оценить в ходе суспензионного теста, являются концентрация дезинфицирующего средства и время контакта.

Время контакта

Каждому химическому дезинфицирующему средству требуется определенный период времени, в течение которого оно должно контактировать с микроорганизмом, чтобы инактивировать или уничтожить его. Это называется «время контакта».⁶

Время контакта зависит от концентрации дезинфицирующего средства и выражается для каждого дезинфицирующего средства в его оптимальном диапазоне концентраций. При постоянной концентрации ДС его эффект увеличивается во времени, пока не будет достигнутооптимальное время контакта.

Важно, чтобы время контакта соблюдалось, при недостижении времени контакта ДС менее эффективно против микроорганизмов.

На время контакта также может влиять характер загрязнения. Хотя дезинфицирующие средства оцениваются в «загрязненных» условиях, наличие грязи может значительно снизить их эффективность.⁸ Поэтому перед дезинфекцией всегда следует проводить предварительную очистку. Это помогает физически удалить загрязнения, такие как видимая грязь и остатки белков.

Концентрация ДС

Дезинфицирующие средства имеют разную эффективность в зависимости от используемой концентрации, и даженебольшие колебания концентрации могут существенно повлиять на эффективность дезинфицирующего средства.Научные данные об эффективности ДС и их концентраций постоянно изменяются в сторону увеличения – цель получить доказательства о гибели всей микробной популяции – это находит отражение в обновлении требований в стандартах испытаний EN.

Некоторые старые версии стандартов EN требовали оценки 1,5%-ной концентрации конкретного дезинфицирующего средства при 5-минутном времени контакта для получения положительного результата. По обновленным стандартамтребует использования 2%-ной концентрации при 15-минутном времени контакта или 4%-ной концентрации при 5-минутном времени контакта для достижения минимального снижения количества микроорганизмов.

Поэтому, прежде чем выбирать какое-либо дезинфицирующее средство для использования следует первым делом проверить, что выбранный ДС прошел тестирование в соответствии с самыми последними версиями стандартов — EN 13624:2021, EN 13727:2012+A2:2015, EN 14476:2025 и EN 17126:2018.

Выбор дезинфицирующих средств, протестированных по более старым стандартам, может означать, что их концентрация слишком низка и/или время контакта слишком короткое, чтобы гарантировать уничтожение или инактивацию патогенов до степени, когда они больше не представляют угрозы.

Так же следует всегда помнить, что панели микроорганизмов, которые используются в данных стандартах – ограничены. И не представлены всем списком Фармакопейных штаммов.

Даже больше, данные тест микроорганизмы зачастую не являются самыми распространнеными жителями чистых помещений, или самыми устойчивыми микроорганизмами. Например: Для подтверждения фунгицидных свойств дезинфицирующие средства тестируются на Trichophyton и Aspergillus (Deuteromycota). Эти испытания проводятся в соответствии с методами методами EN в для проверки фунгицидных свойств. При этом не проводится проверка эффективности в отношении цветных Deuteromycota, Ascomycota, или Zygomycota – которые являются самыми устойчивыми к действию ДС видами плесневых грибов и жителями ЧП.

Поэтому черезвычайно важно не полагаться в своем выборе только на результаты тестов производителя согласно стандарту EN, но и проводить валидацию используемых дезинфектантов под свои условия на своих штаммах.

Выбор правильного ДС должен иметь мультифакторный анализ, состоящий из выбора конкретного производителя, формы выпуска, изучения прилагаемой документации, способ применения и возможностей достижения значимых концентраций/времени контакта, целей дезинфекции, критичности процесса где применяется уборка, результатов валидации включая домашний штаммы, адаптации процедуры уборки под конкретный ДС (остаточные вещества), безопасности ДС для персонала.

Ссылки на материалы, используемые для подготовки данной статьи:

What is EN 14885

Contec: disinfectants and solutions for critical environment

#gmp

#microbiology

#biocides

#en

#desinfectants

#validation

#cleanrooma

#em

#микробиология

#фарма

#дезинфектанты

#европейскиестандарты

#эффективность

#валидациядезинфектантов

#биоциды

Кейс компании Barr Laboratories: история появления требований к расследованию OOS

2026-02-18T12:29:23.036Z

«Каждый день миллионы людей в Соединенных Штатах и других странах с уверенностью и надеждой прибегают к таблеткам, порошкам, капсулам и сиропам, чтобы облегчить или предотвратить бесчисленное количество физических и психических заболеваний. Важнейшая задача обеспечения качества … лежит на Управлении по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), которое контролирует деятельность фармацевтической промышленности посредством системы разрешений и расследований»

С этого поэтического заявления начинается история возникновения современных требований к расследованию OOS (out of specification - результат вне спецификации) при производстве и контроле качества лекарственных препаратов.

В 1991 году крупной генериковой компании Barr Laboratories Inc. было выдано предписание FDA после проведенных инспекций площадок в течении нескольких лет. Результаты этих проверок стали поводом для судебного процесса между компанией и регулятором, процесса который вылился в противостояние бизнеса против регулятора и завершился созданием первого документа «Guide to Inspections of Pharmaceutical Quality Control Laboratories» (FDA, 1993) и позднее документа Investigating Out-of Specification (OOS) Test Results for Pharmaceutical Production Guidance for Industry в Ноябре 1998 года.

История компании

Компания Barr Laboratories Inc была основана в 1970 году в Нью Йорке и к моменту появления судебного противостояния с FDA, насчитывала 30 летнюю историю производства ЛС по 175 наименованиям. К моменту судебного иска FDA отказало компании в 24 новых регистрациях и предписало отозвать 12 серий препаратов с рынка. В течении судебного разбирательства компании пришлось отказаться от 115 наименований и сократить свой портфель до 60 препаратов.

К 2008 году путем множественных слияний и поглощений компания была выкуплена генериковым гигантом Teva Pharmaceuticals.

Предпоссылки судебного иска

В августе и сентябре 1989 года инспектора FDA провели обычную инспекционную проверку предприятия Barr Laboratories Inc. в Нортвейле, а также отдельные инспекции предприятий в Нортвейле и Помоне (США) с мая по сентябрь 1991 года. По результатам каждой из них была выдана форма 483 (*отчете по результатам инспекции- примечание автора), в которой были отражены серьезные нарушения правил надлежащей производственной практики (CGMP).
В отчете по результатам инспекции за 1989 год насчитывалось шесть общих замечаний: невалидные данные по производству и процедуре уборки, отсутствие расследований причин несоответствий, неполные ежегодные отчеты, и неспособность объяснить необходимость проведения ре-тестов контроля качества.
В ходе инспекции в Помоне в 1991 году FDA подвергло критике девятнадцать продуктов и сделало общие замечания по поводу оборудования Barr Laboratories Inc., журналов по оборудованию, программ стабильности, контроля сырья и процедур документирования.
Инспекция в Нортвейле в том же году также подвергла сомнению качество отдельных партий и подвергло критике расследование причин несоответствий, валидацию и путаницу с продукцией.

В феврале 1992 года инспектора FDA вновь посетили предприятия Barr Laboratories Inc. в Нортвейле и Помоне. В результате в форме 483 (*отчете по результатам инспекции- примечание автора) за 1992 год было выявлено 75 замечаний в отношении предприятия в Нортвейле и 47 замечаний в отношении предприятий в Помоне, многие из которых также были зафиксированы во время предыдущих инспекций.

Суть судебного разбирательства

После выписанных замечаний и наложенных ограничений на реализацию продукции на рынке, FDA вышла в суд и обвинила компанию Barr Laboratories Inc. в ненадлежащих процедурах тестирования и проверки, выпуске партий лекарственных препаратов, не соответствующих требованиям, и плохом ведении документации.

В ответ BarrLaboratories Inc. заявила, что ее методы работы соответствуют отраслевым стандартам, а выписанные замечания были устранены.
Как заявили юристы компании – существующие требованию к проведению повторных испытаний (ре-тестов) в рамках процедур контроля качества не регламентированы в текущих требованиях GMP и размыты, а значит требования инспекторов FDA не имеют правовой основы и являются вольной интерпретацией отдельных представителей инспектората, и подали встречный иск к регулятору.

В рамках дела были рассмотрены более чем две тысячи страниц свидетельских показаний, около четырёхсот вещественных доказательств и многочисленных заявлений экспертов. Регулятор представил двух свидетелей: государственных инспекторов FDA. Компания подключила команду из статистиков, эксперта по регулированию, доктора, химика-аналитика, эксперта по фармацевтической биологии, и многочисленных сотрудников компании Barr.

Судья рассматривающий дело описал процесс как «конфликт между лишённым чувства юмора надзирателем и его несговорчивым заключённым».

FDA вышла в суд с рядом заявлений, основанных на выданных ранее замечаниях:

• Неоднократные нарушения надлежащей производственной практики
• Недостаточная полнота расследования причин несоответствий

• Необходимость вынесения судебного запрета на деятельность компании для защиты общественного здоровья

• Неправомерное использование методов повторного тестирования и повторного отбора проб:

- FDA утверждает, что один не соответствующий спецификации результат, который нельзя аннулировать, подвергает всю партию забраковке (поскольку изменчивость анализа и прибора заложена в процедуру USP, партия считается бракованной, если имеет один несоответствующий результат). Barr Laboratories Inc. толкует требования более либерально и отказывается приравнивать несоответствие спецификации целой партии из за получения одного не соответствующего результата из множества измерений.

- FDA обращает внимание на практику компании, где первоначальные результаты, не соответствующие спецификации, отклонялись как лабораторная ошибка исключительно на основании положительных результатов повторных испытаний.

- Barr Laboratories Inc. считает что различные размеры образцов соответствуют требованиям надлежащей производственной практики, и что окончательный выбор является вопросом научного суждения. FDA утверждает, что в формулировке «по мере необходимости» подразумевается требование к размеру образца, равному от одного до трех раз массы продукта. В основе этой теории лежит опасение, что больший размер образца разбавит или даже нивелирует любую неоднородность смеси.

• Выпуск партий лекарственных препаратов на основе выборочных данных

- FDA утверждает, что производственные процессы компании Barr Laboratories Inc. не валидированы из-за высокого процента брака продукции, а также что попытки компании ретроспективно подтвердить валидность производственных процессов не имеют смысла, поскольку компания исключила данные о бракованных партиях из своего анализа. Ссылаясь на проведенные ретроспективные валидационные исследования, компания Barr Barr Laboratories Inc. утверждает, что производит каждый из шестидесяти продуктов своей текущей линейки в соответствии с валидированным процессом и, следовательно, соответствует требованиям надлежащей производственной практики (CGMP).

- FDA утверждает, что высокий процент брака продукции компании Barr Laboratories Inc свидетельствует о необходимости пересмотра основных производственных процессов. Суд соглашается с этим утверждением, если в партиях, включенных в ретроспективные исследования, процент брака составляет десять процентов или более. Практика компании, заключавшаяся в отклонении первоначальных результатов тестов, не соответствующих спецификации, на основании приемлемых результатов повторного тестирования, не соответствует стандарту надлежащей производственной практики.

Урок истории

По результатам слушаний суд признал, что компания Barr Laboratories Inc. внесла некоторые улучшения, но расценил их как в значительной степени продиктованные угрозой судебного разбирательства, а не подлинным стремлением к соблюдению нормативных требований.

Суд так же признал расследования несоответствий компанией Barr Laboratories как проведенные ненадлежащим образом из за отсутствия документации и своевременного реагирования.
Суд признал использование компанией Barr Laboratories методов повторного тестирования и отбора проб неправомерным и научно необоснованным, что способствовало выпуску продукции, не соответствующей требованиям.
Суд счел необходимым вынести предварительное судебное предписание для защиты общественного здоровья в связи с постоянным и повторяющимся характером нарушений со стороны компании Barr Laboratories и потенциальным риском несоблюдения требований в будущем.

Компания Barr Laboratories Inc. получила предварительный судебный запрет на деятельность, и необходимость подтверждения соответствия определенных продуктов требованиям законодательства.

После получения данного судебного решения регулятор FDA впервые разработал основы работ с OOS результатами в практике контроля качества, базовые требования которой распространились в последующие годы в стандарты надлежащей производственной практики регуляторов по всему миру, в том числе и получили свое отражения в требованиях нашей страны.

«В той мере, в какой существующие правила GMP создают двусмысленности, отрасль (фармацевтическая) может обратиться за руководствами к литературе, …, учебникам, справочникам и письмам FDA, или использовать научные данные, когда это уместно. Однако суд не может полагаться на отраслевую практику при определении соответствует отдельная компания требованиям GMP, по той причине что сами отраслевые стандарты должны быть разумными и соответствовать духу и намерениям правил надлежащей производственной практики»

Подробнее о правовом контексте работы с результатами ООS в России можно прочитать в статье 2018 года на портале GxP News «Проблемы OOS. Вопросы компетенции лиц, ответственных за расследование»

#microbiology

#oos

#gmp

#pharma

#barrcase

#fda

#qualitycontrol

#retests

#dataintegrity

#микробиология

#контролькачества

#результатывнеспецификации

#фарма

Микробиологические аспекты валидации очистки (Часть 1 и 2)

2025-10-28T11:57:27.886Z

Перевод статьи Tim Sandell "Microbiological Aspects of Cleaning Validation"

Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина

Введение
Валидация очистки представляет собой подтверждение того, что очистка производственного оборудования действительно удаляет остатки продукта и загрязняющие вещества из частей и элементов оборудования.

Загрязняющие факторы, остатки которых следует очищать могут быть, но не ограничиваются: микроорганизмами; активными фармацевтическими ингредиентами; химическими веществами, образовавшимися в ходе стадий производственного процесса, такими как буферы; чистящими средствами (такие как моющие средства); а также остатки микробиологических питательных сред (при проведении симуляции асептического розлива).

Успешность валидации очистки зависит от эффективности разработанной процедуры очистки и полноты производимых действий.

Как и в случае с любым другим типом валидации, термин «валидация» фактически означает предоставление документированных доказательств того, что критерии приемлемости очистки были соблюдены.

Успешность очистка оценивается на основе уровня остаточного загрязнения (residues), которые обнаруживаются после проведенной процедуры очистки, либо непосредственно на оборудовании, либо косвенно в промывной воде, после финального ополаскивания.

Уровни остаточного загрязнения оборудования должны быть обеспечены на достаточно низком уровне, чтобы гарантировать, что следующий произведенный продукт не будет скомпрометирован отходами или загрязнением от предыдущего продукта (то есть, чтобы не произошло перекрестного загрязнения). Отдельно стоит проблема, связанная с микробиологической контаминацией.

Стандартно очистка оборудования осуществляется с помощью автоматизированного процесса (например, CIP - технологии очистки на месте) или вручную (что часто включает физическое перемещение оборудования в моечный отсек; иногда это называется COP - очистка вне места).
Для эффективности процесса очистки следует избегать ручной очистки, так как она подвержена большей изменчивости в силу человеческого фактора. Там, где
ручной очистки избежать невозможно из-за технических ограничений, необходимо обеспечить надежный контроль для обеспечения полноты процедуры очистки.

Верификация валидации очистки описана относительно хорошо в части проведения химического анализа. Что остается предметом споров и дискуссии так это оценка микробиологической нагрузки в ходе процесса валидации. Стоит ли проводить микробиологические тесты?

Серьезно встает вопрос что является наиболее явным источником контаминации: наличие микроорганизмов и остатков загрязнений как источников роста и развития последних или контаминация, происходящая во время ожидания очистки и/или ее этапов.

Для оценки этих микробиологических рисков требуется надежный план отбора проб на микробиологические показатели.

В этой статье оцениваются риски, связанные с микроорганизмами, и необходимые требования к процессу очистки производственного оборудования, обеспечивающие должный микробиологический контроль над процессом.

Регуляторные требования для валидации очистки

Валидация очистки является обязательным требованием для производства фармацевтической продукции. В США необходимость изложена в Своде федеральных правил (CFR). В частности:

PART 111--CURRENT GOOD MANUFACTURING PRACTICE INMANUFACTURING,
PACKAGING, LABELING, OR HOLDING OPERATIONS FOR DIETARY SUPPLEMENTS
§ 111.27(d) You must maintain, clean, and sanitize, as necessary, all equipment, utensils, and any other contact surfaces used to manufacture, package, label, or hold
components or dietary supplements

PART 211 -- CURRENT GOOD MANUFACTURING PRACTICE FOR FINISHED
PHARMACEUTICALS
§ 211.67 Equipment cleaning and maintenance

PART 820—QUALITY SYSTEM REGULATION
§ 820.70(e) Contamination control

Каждый производитель должен разработать и поддерживать процедуры, предотвращающие загрязнение оборудования веществами, которые могут оказать неблагоприятное воздействие на качество готового продукта. У Управления по контролю за продуктами и лекарствами США и Европейского агентства по лекарственным средствам совместно с PIC/S имеются соответствующие руководства по валидации очистки.

Руководства начинаются с необходимости иметь письменные процедуры, описывающие, как будет проводиться валидация, а также разъясняющие, кто несет ответственность за проведение процесса.

В протоколе валидации должны быть указаны методы оценки; критерии приемлемости; и количество (повторностей) проведенных циклов. Нет никаких нормативных указаний относительно количества необходимых повторностей в ходе валидации; однако, по умолчанию, обычно выполняется три повторности, чтобы продемонстрировать, что полученные результаты не являются случайными. Выполнение трех повторностей предполагает, что процесс является последовательным. Однако на это количество могут влиять другие переменные, такие как различные типы продукта, где могут потребоваться выполнение большего количества циклов очистки. Методы, выбранные для каждого этапа оценки, сами должны быть валидированы.
Также следует добавить примечание о том, когда требуется повторная валидация и временной интервал между первоначальной валидацией и повторной. Что касается критериев приемлемости, большинство международных регуляторов не устанавливают критерии приемлемости, а вместо этого ожидают, что производитель сам определит их на основе оценки риска. Микробиологические критерии приемлемости будут описаны далее.

При рассмотрении вопроса о покупке нового оборудования для производства необходимо учитывать требования к валидации очистки и включать ожидаемые результаты валидации очистки в Спецификацию требований пользователя (URS).

Типы валидации очистки

На валидацию очистки влияет время, которое оборудование стоит до, после и во время процесса. Микробиолог предприятия должен иметь возможность влиять на выбор используемых средств для очистки и качество используемых чистых сред (таких как вода и сжатый воздух, а также состояние контролируемой среды или чистого помещения, в котором оборудование хранится или обрабатывается).

В чистых помещениях рекомендуется контролировать влажность в зонах, где размещается и хранится оборудование (до и после очистки), чтобы снизить уровень влажности (учитывая, что влажная среда поддерживает выживание и рост многих микроорганизмов и имеет особую связь с грамотрицательными бактериями и грибами).

Химические вещества используемые в очистке

Типы выбранных чистящих средств в зависимости от природы химического вещества и вида (и количества) микроорганизмов, присутствующих на данной поверхности будут оказывать различное воздействие.

Чистящие агенты, которые представляют собой комбинацию: щелочное соединение (на основе гидроксида натрия) и кислоты (такой как соляная кислота), должны быть включены в валидацию очистки.

Подобные средства обычно не включают в исследования валидации дезинфектантов,
что повышает значимость проверки их эффективности в ходе валидации очистки.

Эти агенты будут оказывать определенный уровень микробной инактивации; однако их эффективность на месте использования зависит от таких факторов, как концентрация, температура и время воздействия:

Щелочь

Щелочь — это общий термин, относящийся к коррозионной природе ряда химикатов. Обычно при очистке используется гидроксид натрия или калия. Гидроксид натрия — это алкилирующий агент (щелочь натрия). В процессе обработки гидроксид натрия добавляется в воду, нагревается, а затем используется для очистки технологического оборудования, резервуаров для хранения и т. д. Он может растворять смазку, масла, жиры и отложения на основе белка.

Гидроксид калия — это бесцветное твердое вещество; при прочих равных условиях он похож на гидроксид натрия.

Эти химические вещества могут уничтожать микроорганизмы путем окисления и могут проявлять депирогенизирующий эффект, разрушая бактериальный липополисахарид при условии соблюдения достаточного времени контакта.

Кислоты

Кислоты, используемые при очистке производственного оборудования, включают соляную кислоту и лимонную кислоту. Эти кислоты используются для удаления накипи и минералов. При правильных концентрациях и при достаточном воздействии кислоты могут уничтожать микроорганизмы.Хелатирующие агенты такие как ЭДТА (EDTA).

Поверхностно-активные вещества

Поверхностно-активные вещества, используемые при очистке производственного оборудования, включают лаурилсульфат натрия и додецилбензолсульфат натрия. Такие агенты увеличивают дисперсию и эмульгирование загрязнений. Они могут помочь отделить микроорганизмы от поверхностей.

Растворители

Растворители помогают удалять органические загрязнения. По мере удаления органических загрязнений микроорганизмы могут быть вытеснены с поверхностей.
Многие коммерческие чистящие средства содержат в составе (помимо воды) поверхностно-активное вещество, щелочь (например, гидроксид натрия) и хелатирующий агент.

Важно отметить, что основное применение многих моющих средств — удаление остаточных загрязнений (residues); и то, что некоторые из них обладают антимикробными свойствами, является плюсом но не основной целью. Поэтому данные химические соединения не следует рассматривать как дезинфицирующие в том смысле, что дезинфекция определяется как известное значение (D-value*) сокращение популяции микроорганизмов, что подтверждается контролируемыми лабораторными исследованиями.

Помимо применяемых химических веществ, другие аспекты процесса очистки могут оказаться пагубными для выживания микроорганизмов. К ним относятся температура воды, используемой для очистки (особенно там, где температура выше 60 C) и диапазоны pH ниже 4 и выше 11.

Промывные воды

Стадия промывки водой удаляет чистящие вещества и вымывает микроорганизмы, находящиеся в планктонном состоянии (свободно плавающие). Финальная промывка водой проводится водой для инъекций (актуально для всех типов фармацевтических продуктов).

Важный момент, который требует внимание - не оставлять оборудование заполненное промывной водой после финальной промывки. По этой же причине последний этап процедуры очистки должен включать сушку, возможно, с добавлением растворителя (например, 70% стерильного изопропилового спирта) или промывку стерильным сжатым
воздухом; таким образом, гарантируя отсутствие влажности, а значит и отсутствие возможности для роста микроорганизмов.

Типичный процесс очистки оборудования:

1. Инициация, например водой очищенной для очистки от первичных загрязнений
2. Очистка, например нанесение чистящего агента. Может быть 1-ступенчатой или многоступенчатой (например, с применением щелочи, а затем кислот)
3. Промывка (очистка от чистящего агента, обычно водой очищенной)
4. Финальная промывка, используя воду для инъекций (зависит от производимого продукта)
5. Сушка (например, сжатый воздух)

Критические параметры процесса и критические параметры качества

На основании вышеизложенного, подходящими критическими параметрами процесса для проверки очистки являются:

• Время (максимальное время ожидания в грязном и чистом состоянии; время выполнения процесса очистки).
• Активность (химическое воздействие, количество промывок водой и т. д.).
• Химические агенты (концентрация).
• Температура (температура очистки).
Критические параметры процесса являются ключевыми переменными, влияющими на производственный процесс.

Анализ рисков

Уровень необходимой очистки зависит от стадии процесса, на которой используется оборудование, и приемлемого уровня остаточного микробного загрязнения (если таковое имеется). На ранних стадиях производственного процесса оборудованию обычно требуется более легкий уровень очистки (по сравнению с оборудованием, используемым для продукта, находящегося на промежуточной или конечной стадии).

Более того, уровни очистки должен быть выше, если за очисткой
следует санитарная обработка (химическими веществами с доказанными дезинфицирующими свойствами, такими как гипохлорит натрия; или паром) или стерилизация (как это требуется в отношении производства стерильных продуктов). Это приводит к разделению производства стерильных и нестерильных продуктов и степени остаточных микроорганизмов. Допустимые уровни для оборудования, используемого при нестерильном производстве, требуют отдельной оценки рисков и установления пределов по сравнению с оборудованием, используемым для асептического производства. Эти нюансы изложены в этом разделе.

Остаточные загрязнения продуктом, содержащие консервант (например, при производстве нестерильной мази), вероятно, будут представлять меньший риск, чем белковый продукт.
Различные микроорганизмы могут формировать различные типы реакций с остаточными загрязнениями с точки зрения прикрепления к поверхности оборудования. Такой риск трудно просчитать, поэтому необходимо придерживаться цели максимального снижения микробного загрязнения.

Дополнительные микробиологические вызовы связанные с хранением оборудования:
d) Эффективность процесса очистки для удаления микроорганизмов и эндотоксинов;
e) Хранение оборудования после очистки перед использованием или последующим этапом дезинфекции или стерилизации (в отношении повторного загрязнения из окружающей среды).

Каждый из этих сценариев должен быть предметом оценки риска.

Микробиологические тесты для оценки эффективности очистки

При микробиологическом тестировании лучше всего использовать комбинированный подход, поскольку разные методы обнаруживают разные типы загрязнений.

Первая группа методов — это методы прямого отбора проб, которые покажут уровень оставшегося на поверхностях загрязнения. Они особенно полезны при ориентировании на области, которые труднее всего очищать. Вторая группа — это косвенные методы в форме смывов с оборудования и технологических участков оборудования.

Такие методы свидетельствую лишь о том, что финальная промывка оборудования была успешна и что загрязнение больше не смывается с поверхности и более применима в случае проведения анализа на бактериальные эндотоксины так как
остается единственным практичным способом измерения их.

Микробиологические тесты подразделяются:

Метод прямого отбора проб

Осуществляется либо с помощью свабов (зонд-тампоны), либо контактных пластин. Из двух методов контактные пластины, как правило, предоставляют более точные результаты. Контактные пластины позволяют определить уровень обсемененности для установленной площади поверхности (на основе площади поверхности агара, которая составляет от 24 до 25 см2).
Свабы в свою очередь имеют больше вариабельности в части предоставления результатов, так как смачиваемость зонд-тампона и количество движений при отборе сложнее контролировать. Контактную пластину, используют со специальным аппликатором, который имеет валидированные показатели времени контакта и давления при отборе.

Свабы используют преимущество при мониторинге оборудования, которое невозможно отобрать с помощью контактной пластины из-за его конструкции, например, изогнутой или цилиндрической поверхности.

Вне зависимости от выбранного метода, и контактные пластины и свабы должны быть отвалидированы до проведения валидации очистки, чтобы показать, что они пригодны к использованию для мониторинга (восстановления микроорганизмов) данного типа поверхностей.
Не существует отраслевых стандартных критериев приемлемости. Существуют меры, которые можно предпринять для максимизации восстановления, такие как использование аппликаторов при работе с контактной пластиной (которые контролируют время и давление) и подбор типа сваба (где ворсистые свабы обеспечивают более точное обнаружение по сравнению с тампонами с острым наконечником).

Ни один из предложенных методов не обеспечит 100% улавливание всего загрязнения, микробиолог должен знать об ограничениях различных методов и понимать, какие из них являются наиболее точными. Кроме того, используемые питательные среды, а также температура и время инкубации должны быть квалифицированы с точки зрения роста и размножения микроорганизмов.

При прямом отборе проб критическое значение имеет правильность выбора точек мониторинга. Многие подходы к валидации очистки предполагают, что остатки химических агентов равномерно распределены по поверхности оборудования. Однородность распределения химических веществ может иметь место, этот подход трудно применим к микроорганизмам. Точки для мониторинга должны выбираться на основании оценки наихудшего возможного микробного загрязнения в локациях, которые потенциально труднее всего очищать.

Метод смыва с поверхности

В отличие от прямого отбора проб, метод смыва дает косвенные показатели чистоты. Промывные воды могут лишь подтвердить качество промывной воды, но не поверхности.

Метод смыва особенно применим в случаях, когда необходимо проанализировать чистоту большой площади поверхности или когда части оборудования не могут быть разобраны и рассоединены для прямого отбора проб.

Однако один только метод смыва не достаточен для проведения оценки микробиологического статуса оборудования. Так как микроорганизмы могут оставаться прикрепленными к поверхностям оборудования, формируя конгломераты, которые подвергаются не достаточной обработке химическими веществами и промывными водами.

Промывные воды обычно проверяются на бионагрузку с использованием метода мембранной фильтрации, где минимум 100 мл тестируется с использованием фильтра 0,45 мкм. Этот объем достаточен с точки зрения соответствия требованиям фармакопеи, при условии, что образец является репрезентативным.

Можно взять образец большего объёма, поскольку присутствующие микроорганизмы не однородно распределены в объёме образца; контраргументом такого подхода является что если отбор проб с финальной промывки был корректно проведен по времени (после очистки), то не будет происходить восстановление микроорганизмов на поверхности, а значит объем 100 мл является репрезентативным. Выбранная питательная среда так же должна быть пригодна для исследований воды (например, агар R2A пригоден для воды для инъекций). По мере тестирования микробиологических образцов следует сообщать о любых проблемах с сопутствующими химическими анализами. Если, например, уровень общего органического углерода в образце высок, это может означать, что промывная вода содержит химические остатки, и это может сделать микробный тест не валидным.

Требование к тесту на эндотоксины всегда должно применяться к оборудованию, которое будет стерилизоваться и использоваться в производстве стерильных продуктов.
Высокие уровни эндотоксина устойчивы к стандартным температурам последующей обработке очищенного оборудования (например, стерилизации).

Для не стерильного производства необходимость оценки промывных вод на бактериальные эндотоксины должна определяться оценкой риска. Наиболее распространенным методом анализа эндотоксина в воде является ЛАЛ -тест.

Идентификация микроорганизмов

При использовании методов, описанных выше, важно в начале оценить уровень микробной нагрузки, а также типы выделяемых микроорганизмов. Идентификация выделенных микроорганизмов до рода в данном случае будет оправданной, так как только благодаря проведенной идентификации возможно разработать правильную программу очистки оборудования и подобрать необходимые химические агенты.

Рутинный контроль процесса производства

При разработке процесса очистки необходимо так же оценивать условия использования оборудования, то есть после завершения всех методов очистки (и любой последующей санитарной обработки или стерилизации).

В таком случае допустимо тестирование бионагрузки образца продукта с использованием метода общего микробного числа (например, методом мембранной фильтрации). Следует отметить, что такое тестирование является косвенной мерой и должно использоваться только для подтверждения эффективности очистки, а не вместо нее.

Мониторинг окружающей среды

Необходимо гарантировать надлежащее хранения оборудования, как до, так и после обработки (например, очищенное оборудование должно быть полностью отделено от грязного оборудования, а очищенное оборудование не должно храниться во влажной зоне, такой как моечный отсек). Информацию о пригодности зон для хранения оборудования можно получить из данных мониторинга окружающей среды, полученных в результате мониторинга, проводимого в зонах хранения последнего.

В дополнение к оценке микробиологического статуса зон хранения необходимо учитывать временной интервал, в течение которого оборудование остается чистым, это является важнейшей частью работ по валидации очистки.

Из всех используемых методов, описанных выше, метод прямого отбора проб, является наиболее репрезентативным с точки зрения подтверждения очистки.

Так как при отборе проб со стадии последнего ополаскивания (финальная промывочная жидкость) можно получить данные лишь о том, что количество ополаскивании (и химическая обработка до этого) было достаточными, однако контаминация может остаться прикрепленной к поверхности и не обнаруживаться в образце промывной воды.

Установка критериев приемлемости

Регуляторные органы не дают прямых указаний о критериях приемлемости микробиологических испытаний валидации очистки.
Это связано с тем, что приемлемые критерии могут быть определены только путем оценки риска, и зависят от типа производственного процесса (стерильное/не стерильное производство).
Хотя критерии не определены Фармакопея США, Европейская Фармакопея указывают:
• Для бионагрузки: не более 10 КОЕ/100 мл;
• Для эндотоксинов: не более 0,25 ЕЭ/мл.

Для поверхности может быть принято значение равное для теста на бионагрузку, то есть не более 10 КОЕ на см2 (для контактной пластины) или на зонд-тампон.
Для нестерильного оборудования широко используется формула, разработанная Docherty в 1999 году.

Документация

Поскольку валидация очистки является документированным процессом, микробиологические параметры валидации очистки необходимо регистрировать.

В документации следует охватить следующие моменты:
• Образцы для микробиологических испытаний: типы и количество образцов, например, промывные воды, зонд-тампоны, контактные пластины и др.
• Схема отбора проб, показывающая, где отбираются образцы для микробиологического тестирования
• Ссылка на стандартные операционные процедуры отбора проб.
• Подтверждения наличия обучения по отбору проб
• Чек-лист для записи времени отбора образцов
• Условия передачи образцов
• Время поступления образцов в микробиологическую лабораторию.
• Подробности испытаний
• Список всех расходных материалов и номеров их партий (например, номер партии использованных зонд-тампонов)
• Раздел результатов
• Критерии приемлемости
• Запись любых отклонений от процедуры
• Заверение результатов руководством лаборатории.

Сложности остатков химических загрязнений

Хотя эта статья посвящена оценки микробиологического статуса оборудования после очистки, важно, чтобы микробиолог понимал риски, связанные с любыми оставшимися загрязнениями технологического оборудования. Белок из самого продукта или остатки питательной среды (например, после проведения симуляции асептического розлива), могут выступать факторами роста для любых микроорганизмов, которые смогут выжить в процессе очистки, и загрязнят оборудование во время хранения. Размножение микроорганизмов при наличии питательных веществ и благоприятных температур велико.

При проведении валидации очистки часто выбирается один загрязняющий агент как «наихудший случай». Выбор часто основан на таком факторе, как вязкость.
Следует уделить внимание способности загрязняющего агента поддерживать и стимулировать рост микроорганизмов. Вязкое вещество, которое не является субстратом для роста и размножения микроорганизмов может представлять меньший риск, чем вещество, способствующее росту, например, остатки питательной среды. При оценке риска важно время выдержки оборудования в грязном состоянии, поскольку чем дольше агент, способствующий росту, остается в контакте с оборудованием, тем больше вероятность микробиологического размножения.

Когда проводить исследования

Валидация очистки должна проводиться в конце процесса очистки. Это должно происходить
сразу по окончания очистки (пробы финального ополаскивания) и как только оборудование высохнет (для прямого отбора проб с поверхности).
Также необходимо определить, как долго оборудование можно оставлять после использования и без очистки. Последнее сопряжено с риском увеличения уровня контаминации вследствие размножения микроорганизмов.

Существуют два ключевых понятия в отношении оборудования - «время чистого хранения» и «время грязного хранения». Время чистого хранения — это время между завершением очистки и началом следующей производственной операции. Что касается времени грязного хранения - оно определяется как время между окончанием производства и началом процесса очистки. Валидация очистки должна оценивать максимальное время грязного хранения, поскольку такое оборудование сложнее очистить (с течением времени загрязнение становится труднее удалить), и вероятность накопления любого микробного загрязнения с течением времени растет.

Причины неудач микробиологических тестов

Обнаружение микроорганизмов в промывной воде свидетельствует о том, что обработка с применением химических агентов была недостаточной, либо недостаточными являются количества ополаскивании. Когда микроорганизмы обнаруживаются в образцах с поверхностей, это означает, что произошло их прикрепление и что может потребоваться пересмотр подхода к очистке.
Иногда наличие случайных вылетов микробиологического роста может указывать на биопленку, где высвобождение микроорганизмов происходит по непредсказуемой схеме.

Биопленка — это группа микроорганизмов, где клетки прикрепляются друг к другу и к поверхности. Биопленки образуют многие бактерии, включая грамположительные (например, Bacillus spp и Staphylococcus spp) и грамотрицательные виды (например, Escherichia coli или Pseudomonas aeruginosa).
Биопленка не всегда возникает, в следствии прикрепления микробной клетки к поверхности, на ее образование влияют тип и состояние поверхности (например, наличие микротрещин), время и тип микроорганизма и их количества; микробная клетка может прилипнуть к поверхности либо временно («обратимо») либо необратимо.Клетки микроорганизмов в биопленке показывают большую устойчивость к экстремальным условиям : устойчивы к химической обработке и промыванию.Промывки сами по себе слабо влияют на биопленку и не могут удалить ее с поверхности.

Эффективность очистки и дезинфекции будет частично зависеть от того, каким образом бактерии прикреплены к поверхности: обратимо или не обратимо.
Дезинфектанты наиболее эффективны для микроорганизмов, находящихся в суспензии, в планктонном состоянии, эффективность вырастает при увеличении времени контакта и поднятии температуры. На это опираются схемы мойки очистки и дезинфекции, однако по этой причине биопленки показывают высокую выживаемость. По этим причинам основная цель очистки и дезинфекции оборудования не бороться с биопленками, а препятствовать их формированию. Необходимо снижать количество застойных зон через соответствующий дизайн оборудования.

Дизайн оборудования

Оборудование должно быть спроектировано таким образом чтобы оставаться доступным для обслуживания и очистки. Примером неудачного дизайна и проектирования может выступать трубопровод, где используются шаровые краны. Вторым примером - длинная магистраль трубопровода. Оценка проекта должна включать застойные зоны и связанный с ними риск образования биопленки.

Метод очистки

Среди явных ошибок программы очистки оборудования внимание заслуживают две: неверный выбор химического агента или не достаточное количество ополаскивании.
Иногда химический агент может быть подходящим, но время контакта или рабочая температура могут быть неподходящими. В ходе валидации очистки важно так же оценить временной интервал после окончания производства и до начала процедуры очистки. Так как по мере высыхания оборудования количество загрязняющих остатков может повлиять на проникающую способность чистящего или дезинфицирующего средства и существенно снизить антимикробную активность последних.

Ошибка отбора проб

Ошибка отбора проб может возникать, если, например отдельный клапан для отбора проб не подлежит процессу очистки (полностью или частично). Ошибки при отборе проб могут также возникнуть, если не соблюдается инструкция по отбору проб.

Хранение оборудования

Наряду с очисткой оборудования необходимо принять меры для предотвращения повторной контаминации.
Микробиологический риск возникает из-за того, что оборудование остается влажным после очистки. Например, из-за застоя воды, остающейся внутри оборудования. Оставшаяся вода является источником роста для вегетативных клеток. Если оборудование остается сухим, возможности для размножения микроорганизмов значительно сокращаются.

*Примечание переводчика

#gmp

#pharma

#microbiology

#cleaningvalidation

#timsandell

#микробиология

#фарма

#валидацияочистки

Микробиологические аспекты валидации очистки (Часть 1 и 2)

2025-09-23T12:34:46.816Z

Перевод статьи Tim Sandell "Microbiological Aspects of Cleaning Validation"

Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина

Регуляторные требования для валидации очистки

PART 211 -- CURRENT GOOD MANUFACTURING PRACTICE FOR FINISHED
PHARMACEUTICALS
§ 211.67 Equipment cleaning and maintenance

PART 820—QUALITY SYSTEM REGULATION
§ 820.70(e) Contamination control

Типы валидации очистки

Химические вещества используемые в очистке

Щелочь

Гидроксид калия — это бесцветное твердое вещество; при прочих равных условиях он похож на гидроксид натрия.

Кислоты

Поверхностно-активные вещества

Растворители

Промывные воды

Типичный процесс очистки оборудования:

Анализ рисков

Каждый из этих сценариев должен быть предметом оценки риска.

Микробиологические тесты для оценки эффективности очистки

Микробиологические тесты подразделяются:

Метод прямого отбора проб

Метод смыва с поверхности

Идентификация микроорганизмов

Рутинный контроль процесса производства

Мониторинг окружающей среды

Установка критериев приемлемости

Документация

Сложности остатков химических загрязнений

Когда проводить исследования

Причины неудач микробиологических тестов

Биопленка — это группа микроорганизмов, где клетки прикрепляются друг к другу и к поверхности. Биопленки образуют многие бактерии, включая грамположительные (например, Bacillus spp и Staphylococcus spp) и грамотрицательные виды (например, Escherichia coli или Pseudomonas aeruginosa).
Биопленка не всегда возникает, в следствии прикрепления микробной клетки к поверхности, на ее образование влияют тип и состояние поверхности (например, наличие микротрещин), время и тип микроорганизма и их количества; микробная клетка может прилипнуть к поверхности либо временно («обратимо») либо необратимо.Клетки микроорганизмов в биопленке показывают большую устойчивость к экстремальным условиям : устойчивы к химической обработке и промыванию.Промывки сами по себе слабо влияют на биопленку и не могут удалить ее с поверхности.

Дизайн оборудования

Метод очистки

Ошибка отбора проб

Хранение оборудования

*Примечание переводчика

#gmp

#pharma

#qc

#cleaningvalidation

#microbiology

#timsandell

#микробиология

#фарма

#валидацияочистки

Непоследовательность или не состоятельность: как FDA регулировал краситель красный #3

2025-08-01T11:14:30.251Z

От красных конфет до розовых бургеров - в чем разница?

Розовые бургеры одной известной сети наделали много шума, пока не выяснилось, что в них содержится безопасный красный краситель (E120).

Ранее писали что при собеседовании в конгрессе на должность руководителя FDA (“Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США”) доктор Марти Макари подвергся допросу о сомнительности работы FDA, которая на протяжении десятилетий не решалась на запрет другого красного красителя – Красный краситель №3 (Е127).

Красный краситель Е120, также известный как кармин, - это натуральный красный краситель, получаемый из насекомых кошенили (Dactylopius coccus).

Краситель красный №3 (FD&C red no. 3) или эритрозин, представляет собой йодорганическое соединение, получаемое из каменоугольной смолы или нефти. Розовый краситель, который используется для пищевых целей и представляет собой динатриевую соль 2,4,5,7-тетрайодофлуоресцеина.

Эритрозин обычно используется в сладостях, таких как конфеты и фруктовое мороженое, или кремы для украшения кондитерских изделий. Его также используют для окраски таблеток/капсул и косметических средств (помада, румяна, лаки для ногтей), в качестве пищевой добавки он имеет Е-номер E127.

Влияние на здоровье

Спор о безопасности красителя красный №3 начались в далеком 1970 году после того как был принят пункт Делани к «Закону о красящих добавках».

Смысл пункта сводится к тому, что FDA не должен одобрять использование в пищевых продуктах любых химических добавок, которые, как установлено, вызывают рак у человека или, после испытаний, вызывают рак у животных.

Осенью 1950 года многие дети в США заболели, съев оранжевую конфету на Хэллоуин, содержащую 1-2% FD&C оранжевый No. 1 – красителя, разрешенного к использованию в пищевых продуктах. Эти события побудили FDA пересмотреть все включенные в разрешенный список красители

В 1990 году FDA США ввело частичный запрет на эритрозин, сославшись на исследования 1980-х годов, которые показали, что высокие дозы вызывают рак у крыс.

Хроническое употребление эритрозина может способствовать образованию опухолей щитовидной железы у крыс за счет хронической стимуляции щитовидной железы через гормон ТТГ при условии что 4% от общего дневного рациона состоит из эритрозина

С 1994 года Европейское управление по безопасности пищевых продуктов запрещает использование эритрозина, оставляя его только в переработанной вишне, кормах для домашних животных и в малых концентрациях в зубной пасте.

В таких странах, как Япония и Норвегия, краситель красный №3 запрещен из-за проблем со здоровьем.
В СССР краситель красный 3 был запрещен с 1971 года.

FDA запретило использование красителя красный №3 в косметике и лекарствах наружного применения, НО разрешило его дальнейшее использование в пищевых продуктах и принимаемых внутрь лекарствах.

В июне 2008 года Центр науки в интересах общества (CSPI) обратился в FDA с ходатайством о полном запрете эритрозина в Соединенных Штатах, но FDA не предприняло никаких дальнейших действий.

В дальнейшие годы с ростом заболеваемости синдромом дефицита внимания и гиперактивности у детей связывали наличие красящих добавок в любимой детской пище, такой как хрустящие цветные колечки на завтрак или конфеты. Приведем статьи на этот счет здесь, здесь и здесь.

Исследования на животных показали что синтетические пищевые красители вызывают изменения в нейромедиаторы системах мозга, влияя на активность, память и обучение

В 2011 году FDA созвало Консультативный комитет по продуктам питания (FAC) для рассмотрения вопроса о том, демонстрируют ли имеющиеся данные связь между потреблением детьми сертифицированных красящих добавок в продуктах питания и неблагоприятными последствиями для их поведения. FAC пришла к выводу, что связь между потреблением детьми сертифицированных красящих добавок и поведенческими эффектами не установлена.

Таким образом несмотря на научные исследования и очевидные ограничения по всему миру FDA запретило использование красителя красный №3 для наружного применения, однако оставляло его разрешенным для приема внутрь без каких либо ограничений вплоть до 15 января 2025 года, когда отозвало разрешение на его использование в продуктах питания и для приема внутрь в США. За эту "оплошность" прилетело новому главе FDA и всему ведомству в целом.

#fda

#gmp

#производство

#регуляторика

#красителькрасный3

#reddye3

L-формы бактерий: как стресс формирует устойчивость

2025-06-17T10:58:30.670Z

Перевод статьи Tim Sandell "L-form bacteria: How stress builds resistance"

Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина

Некоторые бактерии могут сбрасывать свою клеточную стенку и формируя новую изменять свою форму, принимая в основном сферические формы. Такие бактериальные изменения известны как L-формы. Эти бактерии не только отличаются формой; они также принципиально отличаются от привычных форм бактерий. Механизм реакции бактерий на стресс способствует образованию бактерий L-формы.

Хотя переход в L-форму зависит от вида микроорганизма и встречается не так уж часто, появление L-форм может представлять опасность для пациентов, и такие организмы сложнее удалить из производственного процесса (включая проблемы со стерилезующей фильтрацией).

В данной статье оценивается феномен бактерий L-формы и рассматривается, что эта форма означает для двух ключевых областей: противомикробные препараты и стерилизующая фильтрация.

Что есть L-форма?

Когда бактерия становится L-формой, она демонстрирует плеоморфную активность. Бактерия сбрасывает клеточную стенку, принимает в основном сферическую форму и способна размножаться посредством почковательных процессов, в которых мембраны материнских клеток образуют дочерние везикулы. Однако не все эти везикулы содержат генетический материал.

Примером L-формы является листерия, которая может менять свою форму с палочкообразной на сферическую. Эти клетки с дефицитом клеточной стенки окружены только одной мембраной (1)*.

Другими примерами являются Escherichia coli, Enterococcus, Enterobacter и Staphylococcus. Бактерии L-формы были впервые обнаружены в 1935 году (2), но об этой форме еще многое предстоит узнать.

Как возникают L-формы?

L-формы были описаны для нескольких типов бактерий. В отличие от Mycoplasma, Rickettsiae и Chlamydiae, каждый из которых является человеческим патогеном, у которого постоянно отсутствует стабильная клеточная стенка, L-формы применяются к бактериям, которые обычно имеют неповрежденные клеточные стенки (3).
Изменение формы происходит за счет дисбаланса между площадью поверхности и объемом, (4).
L-формы могут появляться при воздействии антибиотиков / антимикробных препаратов, активных в клеточной стенке (таких как пенициллин или лизоцим). Некоторые антимикробные препараты заставляют бактерии сбрасывать свою клеточную стенку, что является обычной точкой воздействия для большинства антимикробных препаратов. Образующиеся в результате атаки агентов везикулы заключены только в цитоплазматическую мембрану, что делает эти антибиотики неэффективными.

У бактерий L-форм отсутствуют жгутики, длинные тонкие отростки, которые позволяют некоторым формам бактерий продвигаться вперед, используя хлыстообразные движения. Однако у них остается возможность передвигаться посредством «скольжения».

Зачем нужна клеточная стенка?

Клеточная стенка — это слоистая структура, окружающая клетки, которая защищает их и поддерживает их форму. L-формы не обладают клеточной стенкой и демонстрируют большую хрупкость, но также большую гибкость и пластичность по отношению к окружающей среде.

Обнаружение

Бактерии L-формы гораздо сложнее обнаружить, особенно с помощью стандартных методов культивирования, а стандартное окрашивание (например, по Граму) не будет эффективным ввиду отсутствия клеточной стенки.
Культивирование L-форм бактерий — непростая задача. Рост возможен в жидкой среде; высев на чашку затруднен так как они обычно не образуют колоний (5).

Бактерии L-формы обладают медленным ростом. В случае с Listeria формирование видимой колонии в пробирках с мягкой средой занимает не менее шести дней по сравнению с 16–20 часами для нормальных клеток (6).
Иногда обнаружить L-формы можно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). (7).

Однако при работе с возбудителями человеческих инфекций обнаружение методов ПЦР затруднено, поскольку бактерии L-формы могут сохраняться внутри макрофагов в течение длительного времени (8), и недостаточное для обнаружения количество бактериальных белков и генетического материала попадает в кровоток (9).

Эволюционное развитие

Ученые доказали, что L-формы не только жизнеспособны, но и их репродуктивные механизмы могут соответствовать механизмам первых форм жизни на земле. Первые клетки не обладали жесткими стенками, поэтому они, делились как L-формы.
Таким образом, рост и размножение этих форм бактерий, может дать представление о том, как клетки прородители могли размножаться миллиарды лет назад.

Размножение

L-формы реплицируются без механизма деления клеток бинарным делением.
Когда цитоплазматическая мембрана клетки L-формы инвагинирует в цитоплазму, материнская клетка производит везикулу (тонкостенный мешок), заполненную веществами из окружающей среды. Следовательно, эта первичная везикула лишена клеточных компонентов и, в частности, генетического материала.

Однако, формируя вторичные везикулы посредством мембранной экструзии в первичные, они заполняются цитоплазматическим материалом материнской везикулы, который обеспечивает всеми необходимыми для жизнеспособности компонентами клетки, такими как хромосомы и рибосомы. Последние позволяют бактерии производить белки.
Вновь образованные L-формы в жидкой среде остаются какое то время между собой через нитевидные трубчатые нити липидного материала. Однако везикулы в конечном итоге разделяются.
Однако L-формы размножаются только при определенных условиях. Например, если осмотические условия не подходят или быстро меняются, клетки станут нестабильными и могут взорваться изнутри.

Стерилизующая фильтрация

Одной из проблем фармацевтических производств, особенно при производстве стерильных продуктов с использованием асептического процесса, является то, что, L-формы бактерий могут проходить через фильтр 0,45 мкм из-за гибкости их формы и переменчивых размеров. Также некоторые L-формы могут проходить через фильтр 0,22 мкм (что обычно считается фильтром «стерилизующего класса»).
L-формы отличаются от сверхмалых бактерий, которые могут проходить через определенные фильтры с фильтром пор 0,1 мкм, ( как Hylemonella и SAR324 (некультивируемая водообитаемых бактерий Deltaproteobacteria). Ультрамикробактерии, определяемые как бактерии с объемом клеток <0,1 мкм3; смесь грамположительных, грамотрицательных и лишенных клеточной стенки видов. Относительно небольшой размер ультрамикробактерий также позволяет им паразитировать на более крупных организмах (10).

Хотя L-формы представляют потенциальный риск, использование фильтров 0,1 мкм часто проблематично в фармацевтическом производстве так как замедляет скорость потока и пропускную способность фильтра – увеличивая производственный цикл. Альтернативой является использование двойной фильтрация, хотя и это трудно доказать с точки зрения эффективности.

Является ли L-форма постоянной?

L-форма может быть переходным состоянием бактерии (то есть возможен возврат к форме с клеточной стенкой) или постоянным состоянием, в котором бактерии поддаются культивированию в отсутствии провоцирующего первичное изменение агента (без возврата) (11).

Другая форма жизни?

Некоторые микробиологи считают, что L-формы являются независимой формой жизни, которая может неограниченно и свободно размножаться (12).
Переход от нормальной формы к L-форме сопровождается многими изменениями в метаболизме клеток и активности их генов. В L-формах гены, отвечающие за регуляцию стресса, активируются, а гены метаболизма и энергетического баланса наоборот подавляются. Часто бывает так, что развитие L-формы является ответом на воздействие окислителя.

*Ссылки доступны в оригинальной статье

#bacteria

#microbiology

#bacterialresistance

#микробиология

#тимсэндел

#бактерии

Сложности проектирования и исполнения чистых помещений

2025-06-17T08:41:48.535Z

The complexities of cleanroom design and operation (rssl.com) BY DR TIM SANDLE | 26 March 2024

Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина

Проектирование чистых помещений — это необходимая часть стратегии контроля контаминации, в ходе которой необходимо учитывать множество различных аспектов. Принимать во внимание, только лишь, кратность обновления воздушного потока, недостаточно.

Ключевое при проектирование это понимание вентиляции, которая обеспечивает распределение и движение воздушного потока в рамках закрытого пространства (чистой комнаты). Движение и распределение воздуха внутри замкнутого пространства может быть довольно сложным моментом, который зависит от множества факторов, включая геометрию, форму и размер оборудования внутри нее. Не стоит забывать и о расположении притока и воздухозаборников.

Кратность обновление воздушного потока

Кратность обновления воздушного потока (время, за которое воздух в чистых помещениях заменяется на новый, выражаемое в кратности обмена за час) обозначается как наиболее значимый фактор стратегии контроля, наряду с важностью HEPA воздушных фильтров, хорошим перемешиванием воздуха, и обеспечением дифференциального давления для классов частоты. Воздухообмен выражается как отношение скорости потока воздуха, поступающего в закрытое помещение, к его объему.

Какое же влияние оказывает повышение воздухообмена на контроль контаминации? Одни исследования обнаружили, что повышение с 15 h−1 до 20 h−1 не оказали существенного влияние на снижение количества частиц в классе чистоты B.

Однако, было установлено, что увеличение с 20 h−1 до 25 h−1 снижало время, за которое концентрация частиц оставалась внутри чистого помещения (room residence time to drop from 32% to 21%) (1).

Другие факторы проектирования

Оценка проектирования, основанная лишь на эффективности воздухообмена, имеет несколько ограничений (4). Существует множество факторов, которые влияют на контроль контаминации чистых помещений:

Наличие непрерывного потока частиц
Типы частиц, в зависимости от их массы, движущий силы и значения
Маленькие частицы ((≤0.5 μm) следуют воздушному потоку в сравнении с большими частицами (≥5.0 μm). По этой причине, проектирование помещения зависит от их размера
Наличие микробных клеток на частицах
Скорость оседания частиц на поверхности оборудования
Количество и расположении притоков воздуха и воздухозаборников
Как правило, оптимальным является нисходящий поток (приточные устройства, установленные на потолке), с вытяжными устройствами на более низком уровне на стене (7).
Влияние конфигурации диффузоров и вытяжек на перемещение контаминантов. Например, вихревые диффузоры вызывают более гомогенное распределение воздуха
Влияние внутреннего наполнения комнаты (например тип и дизайн оборудования)
Дизайн комнат и размеры
Температура и влажность чистых помещений
Скорость смешивания воздуха в помещении и ее влияние на концентрацию частиц

Схема воздушного потока

Схема воздушного потока, создаваемая системой вентиляции, определяет поток частиц, в особенности на стыке двух различных чистых помещений или на стыке чистого помещения и барьерной системы.

Использование визуалиции потока (используя генератор дыма) необходимо для изучения путей движения воздушных масс. Результаты данного исследования могут помочь с определением точек для последующего мониторинга.

Стагнация

Чем ближе воздух попадает к объекту, тем медленнее он становится, а наличие определенных конструкций оборудования может замедлять воздушный поток и создавать завихрения. Это может привести к образованию зон застоя воздуха (микросред). Это может привести к образованию зон, где кратность потока не обеспечена, а следовательно, более старые воздушные массы задерживаются в помещении.

Риск чрезмерной турбулентности

Иногда кратность воздухообмена завышена, что является не только малоэффективным с точки зрения управления энергоресурсами, но и вызывает увеличение риска турбулентности и колебаний скорости.

Следовательно, более низкие настройки могут снизить риск нежелательной турбулентности и быть более эффективными с точки зрения удаления контаминации. Нахождение точки этого равновесия - является той задачей, для которой необходимы экспериментальные данные.

Такие методы, как вычислительная гидродинамика, могут оказаться очень полезными для прогнозирования движения воздуха в вентилируемых помещениях, однако последним испытанием является проведение тестов с помощью счетчика частиц с оснащенном состоянии.

Открывание дверей и температурные изменения

Перепад давления обеспечивает некоторую защиту от проникновения загрязнения, когда двери в чистые помещения открыты (в случае положительного давления) или выхода загрязнений из помещений (в случае помещений с отрицательным давлением).

Факторы риска включают повторяющиеся открытия двери и продолжительность времени, в течение которого дверь остается открытой, а также движение через дверь, приводящие к тому, что давление пропадает или даже изменяется возле двери.

Данные показывают, что низкая кратность воздухообмена в сочетании с долгим открытием двери и быстрым движением персонала через открытую дверь повышают риски неконтролируемого проникновения воздуха в чистое помещение (8). Напротив, чем выше перепад давления, тем быстрее будет решена проблема с точки зрения восстановления положительного давления (9).

Еще одним фактором, который может привести к увеличению вероятности загрязнения, является изменение температуры. В помещениях, где существует температурный градиент между теплым воздухом (скажем, внутри комнаты) и более холодным воздухом (например, в коридоре) может создаваться «двусторонний поток» (two-way buoyancy flow’), приводящий к тому, что более теплый воздух поднимается наверх в поисках выхода из помещения, а более прохладный воздух на уровне пола ищет возможность проникнуть внутрь чистого помещения (10).

Изменение температуры в чистых комнатах

Еще одним значительным фактором, влияющим на изменение воздушного потока, является оборудование и исходящее от него тепло. В фармацевтике и здравоохранении многие типы оборудования выделяют значительное количество тепла, и это может создать проблемы с контролем загрязнения через вторичные потоки.

Активность и заполняемость помещений

Частицы, которые опадают со стен, потолка, пыль с пола и от работающего оборудования являются постоянными источниками загрязнения. Когда мы говорим про активность персонала – это фактор, который сложно предугадать.

Люди являются источником частиц (многие из которых переносят микроорганизмы) и непредсказуемой переменной (поскольку поведение персонала не всегда можно тщательно контролировать). При проектировании помещений необходимо учитывать количество персонала, который будет работать в помещении. Любое дополнительное количество работников будет пополнять растущую концентрацию частиц в помещении, несмотря на эффективность и тщательность процедуры переодевания (особенно потому, что частицы, образующиеся при работе каждого оператора, перемещаются вверх по одежде для чистых помещений к голове и падают на ноги во время движений в чистых помещениях) (11).

Было проведено обширное исследование, которое показало, что скорость выброса частиц человеком составляет 50 000–180 000 частиц на человека в минуту (12). В другом исследовании было подсчитано что генерация частиц составляет 1742 ± 481 на кубический метр на каждого дополнительного сотрудника (13).

Величина загрязнения линейно зависит от количества персонала в чистом помещении. Кроме того, скорость разрушения частиц 0.3 μm падает на 50% в присутствии персонала (14).

Помимо заполняемости помещения персоналом важно и то, как персонал ведет себя в критической зоне. В каждой микросреде действуют сложные системы распределения воздушного потока.

Распределение воздуха может существенно меняться в различных условиях, связанных с наличием различных источников тепла (через тепловые шлейфы) и перемещением персонала (15). В частности, активность человека влияет на общее количество частиц в чистой среде (особенно с концентрацией частиц ≥0,3 мкм) (16).

Ссылки

Смотрите в оригинальной статье.

#cleanrooms

#gmp

#aseptic

#microbiology

#pharma

#тимсэндел

#чистыепомещения

#микробиология

#фарма

Обзор обновлений глобальных требований: Американская / Европейская Фармакопеи

2025-06-17T08:39:14.614Z

https://www.rssl.com/insights/life-science-pharmaceuticals/issue-19-pharmaceutical-regulatory-roundup/ BY DR TIM SANDLE | 20 March 2024

Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина

Микробиологические методы для определения контаминации препаратов короткого срока хранения

В Американской Фармакопее (USP) появилась новая статья “Respiration- Based Microbiological Methods for the Detection of Contamination in Short-Life Products”. Данная статья открывает возможности для риск-ориентированного подхода при проведении бионагрузки для препаратов короткого цикла производства или срока годности, в случаях, когда продукт необходимо ввести пациенту как можно скорее после производства. Статья так же может быть использована для проверки технологических растворов, промежуточных продуктов, клеточных сред.

Основное отличие, предлагаемое новой статьей это используемый метод обнаружения микроорганизмов. В классических проверках бионагрузки использовались методы, основанные на росте колоний микроорганизмов в питательной среде, где сигналом присутствия контаминации является наличие видимых признаков микробного роста или осаждения (например мутность, образование пленок или рост хлопьев).

Приборная база новых предполагаемых методов основанных на дыхании, основаны на системах культивирования крови, используемых в клинических условиях, которые используют колориметрические или флуорометрические датчики для обнаружения эскпоненциального увеличения углекислого газа как индикатора роста микроорганизмов. Практика применения подобных методов, для обнаружения загрязнения в различных продуктах с коротким сроком хранения, таких как продукты клеточной терапии, была опубликована в рецензируемой литературе.

В дополнение к статье, упоминаемой выше, Американская фармакопея выпустила черновик статьи “ATP Bioluminescence-Based Microbiological Methods for the Detection of Contamination in Short-Life Products” (Микробиологические методы определения контаминации основанные на биолюминесценции для препаратов короткого цикла хранения).

В данной статье к традиционным методам определения контаминации добавлены методы обнаружения микроорганизмов в жидких или твердых (агаризированных) средах методом АТФ биолюминесценции. Все живые клетки, включая микроорганизмы, содержат АТФ в разной концентрации. Метод АТФ биолюминесценции основан на люцеферин-люцифераз каскаде реакций, результатом которых идет свечение улавливаемое люминометром. Измеряемый свет отображается в величине RLU – относительные световые единицы измерения (relative light units).

Третья статья Американской фармакопее, опубликованная в черновом варианте, называется “Rapid Microbial Tests for Release of Sterile Short-Life Products: A Risk-Based Approach” (Быстрые микробиологические методы для проведения теста на стерильность препаратов короткого срока хранения: риск-ориентированный подход).

В данной рекомендательной статье, широко признается, что текущие классические методы определения стерильности (14-дневная инкубация) не могут быть использованы для продуктов короткого цикла производства и/или короткого срока хранения. Подобные препараты необходимо использовать немедленно после окончания производства. Препараты относящиеся к подобным могут быть многокомпонентными (CSP), радиофармпрепараты, или содержащие аутологичные клетки.

Бионагрузка

В Американской фармакопее (USP) появляется новая статья под названием <1119> «Bioburden Monitoring (Мониторинг Бионагрузки)». В этой статье представлены рекомендации по мониторингу и тестированию бионагрузки, включая рекомендуемые пределы. В главе выделены отличия от микробиологических тестов, которые предназначены для тестирования и выпуска нестерильной продукции и нестерильных субстанций для фармацевтического применения в соответствии с ‘Microbiological Examination of Nonsterile Products: Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations and Substances for Pharmaceutical Use’ (Микробиологические исследования нестерильной продукции: критерии приемлемости фармацевтических препаратов и субстанций для фармацевтического применения).

Существующая статья <1229.3> «Monitoring of Bioburden (Мониторинг бионагрузки)» предполагает использование модифицированных и квалифицированных методов проведения теста, однако не дает детального ответа на то, как это сделать.

Новый черновик статьи <1119.1> отвечает на эти запросы. Статья затрагивает вопросы проведения исследования бионагрузки для растворов и материалов: фармацевтической субстанции, промежуточных растворов, воды, и других компонентов.

Аналитические процедуры

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США анонсировало выход финальных рекомендаций «Q2(R2) Validation of Analytical Procedures» and «Q14 Analytical Procedure Development».

Содержание процедур:

• «Q2(R2) Validation of Analytical Procedures» описывает общие принципы валидации аналитических методов, включая принципы валидации и использования данных спектроскопии

• «Q14 Analytical Procedure Development» приводит гармонизированный э научный подход к разработке аналитических методик и их эффективной, риск-ориентированной оценке на этапе пост-регистрационных изменений. Рекомендация призвана обеспечивать возможную гибкость со стороны регулятора при научно обоснованных пост-регистрационных изменениях аналитических методик.

Ссылки:

https://www.fda.gov/media/161202/download

https://www.fda.gov/media/161201/download

Микоплазмы

Общая фармацевтическая статья Европейской Фармакопеи по микоплазмам претерпевает дальнейшие изменения, с целью внести в нее современные знание в данной области:

• Метод культивирования и метод культуры индикаторных клеток (или, альтернативно, метод NAT) должны использоваться совместно для обеспечения обнаружения как «культивируемых», так и «некультивируемых» микоплазм, если иное не обосновано и не разрешено на основе оценки риска

• Учитывая, что примеси микоплазмы могут прилипать к клеткам или присутствовать в них, образцы должны содержать как клетки, так и супернатант. Однако альтернативные подходы (только культурные супернатанты) также могут быть приемлемыми

• Выбор штаммов (включая дополнительные штаммы), которые будут использоваться в качестве положительного контроля во время обычного теста, и оценка теста на мешающие факторы должны основываться на оценке рисков

• Важнейшие изменения коснулись разделов по валидации методов амплификации нуклеиновых кислот (NAT) для обнаружения микоплазм, чтобы адаптировать их содержание к современному уровню науки и техники (например, штаммы, которые необходимо включить, характеристика жизнеспособных эталонных штаммов, критерий приемлемости для соотношения GC/CFU).

Тест на стерильность

Европейская фармакопея обновляет общую статью, касающуюся проведения теста на стерильность с целью включения альтернативных методов (в соответствии со статьей 5.1.6. «Alternative methods for control of microbiological quality» (Альтернативные методы для микробиологического контроля качества).

Основные предлагаемые изменения:

• В разделе мер предосторожности против микробного загрязнения, требования к окружающей среде и месту проведения теста на стерильность были упрощены, поскольку этот тип информации обычно не определен в Европейской фармакопее

• Удалена строка о том, что тест на стерильность является единственным аналитическим методом, доступным для регулятора

• Информации в части плана отбора проб была дополнена с целью предоставления рекомендаций для продуктов финишной стерилизации и лиофилизированных продуктов

• Рекомендации по признанию результатов теста на стерильность недействительными больше не ограничиваются условием (d) общей главы 2.6.1. «Sterility» (Стерильность)

• Редакционные правки были внесены по тексту для обеспечения большей ясности.

#gmp

#fda

#ema

#pharma

#microbiology

#testforsterility

#pharmacopeia

#фармакопея

#фарма

#микробиология

#аналитическиеметодики

#тестнастерильность

#бионагрузка

#usp

#q14

#csp

«Дикий тип»: реальная применимость домашних штаммов при микробиологическом тестировании

2025-06-17T08:33:55.521Z

Walk on the wild side: The application of environmental isolates in microbiological testing BY DR TIM SANDLE | EJPPS | 14 March 2022

Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина

В течение последнего десятилетия наблюдалась тенденция к использованию домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды в качестве тест организмов при проведении тестирований в фармацевтических микробиологических лабораториях. Примерами подобных практик являются аттестация микробиологических методов (таких как проверка пригодности метода (АМД – примечание переводчика)), тест на ростовые свойства питательных сред, а также оценка эффективности дезинфицирующих средств ¹. Основная движущая сила, стимулирующая использования домашних штаммов (локальных изолятов), исходила от регулирующих органов (не существует иной литературы, описывающей подобное применение). По словам представителя FDA, последние ожидания регулирующих органов в отношении использования домашних штаммов (локальных изолятов) из производственной среды для проверки качества питательных сред подтверждаются многочисленными замечаниями, выписанными U.S. FDA² в последние годы. Использование домашних штаммов (локальных изолятов) также соотносится с представлениями многих микробиологов о том, что им необходимо расширять панель тест микроорганизмов, чтобы доказать надежность, робастность и воспроизводимость применяемых микробиологических методик.

Однако, учитывая, что для этих целей легко подходят типовые штаммы микроорганизмов из утвержденных коллекций, считается необходимым задуматься о достаточности аргументации для внедрения домашних штаммов производственной среды в рутинную практику.

Вариабельность

Происходящие в популяции микроорганизмов фенотипические вариации - не оспоримый факт, и он дает эволюционное преимущество, от адаптации к новым условиям до персистирующих субпопуляций, выживающих при губительных воздействиях противомикробных препаратов или дезинфицирующих средств. Основным аргументом в пользу использования домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды является предположение, что такие штаммы (изоляты) будут демонстрировать иные характеристики микробного роста и, таким образом, в некотором роде будут «более выносливыми», чем лабораторные штаммы, полученные из коллекционных культур. Бактерии, подвергнутые воздействию изменчивой производственной среды, станут демонстрировать большую адаптивность к новым условиям ³. В свою очередь, это основано на представлении, что производственные штаммы обладают характеристиками «дикого типа», которые сохраняются в течение определенного периода времени или в течение установленного количества пассажей.

Под «диким типом» подразумевается, что либо произошел отбор (выживание более приспособленных представителей микроорганизма), либо изолированные микроорганизмы проявляют отличные фенотипические характеристики – специфические признаки (на уровне вариаций между отдельными клетками), которые видимы микробиологу и не всегда отражаются в микробном геноме.

Более того, два различных вида микроорганизма никогда не будут адаптироваться одинаково в одних и тех же стрессовых условиях (существуют различия в фенотипической пластичности), и в пределах одного вида субпопуляции будут вести себя по-разному ⁴. Не существует единого мнения о том, какие фенотипические характеристики важны, они будут различаться в зависимости от типов воздействий, которым подвергался микроорганизм. Среди адаптивных черт возможны: изменение размера клеток ⁵; потребность в различных или измененных уровнях питательных веществ (диауксический сдвиг) ⁶; различия между подвижными и неподвижными клетками ⁷. Самой интересной адаптивной характеристикой является скорость роста, учитывая подчеркнутое сосредоточение фармакопеи на «времени инкубации» как части критериев приемлемости для микробиологических методов.

Второй спорный в среде микробиологов вопрос, заключается в том, продолжают ли возникшие однажды фенотипические изменения (характеристики «дикого типа») присутствовать после того, как организм был пересеян на богатые питательными веществами лабораторные среды, или же организм становится фенотипически гетерогенным, демонстрируя характеристики в зависимости от типа питательных сред ⁸. Кроме того, если эти особенные характеристики «дикого типа» сохраняются, то как долго или через сколько этапов пересевания они остаются достаточно значимыми, чтобы влиять на рост колоний.

Культивируемость

Набор тест микроорганизмов, рекомендуемых фармакопеями, национальными и международными стандартами существует для обеспечения воспроизводимости между лабораториями при проведении одних и тех же микробиологических методик анализа. В случае большинства стандартов они разработаны для многоцелевого применения, а иногда и для многоотраслевого применения. Однако набор указанных тест штаммов может подходить или не подходить для каждого конкретного метода или производства, так как списки не менялись последние десятилетия. Стабильность в этой части регуляторики легко обьясняется усиленным развитием современных знаний о микробных рисках, за которыми фармакопея или стандарт CEN или ISO не успевают. Одной из важных задач микробиолога на фармацевтическом предприятии является рассмотрение списка тест штаммов и решение о необходимости его дополнения. Например, существуют веские аргументы в пользу включения Micrococcus luteus в список микробиологических тест штаммов для оценки сред, используемых для мониторинга производственной среды, учитывая общую связь этой бактерии с микробиомом внешних слоев кожи человека ⁹, а также тот факт, что на Micrococcaceae приходится значительная доля организмов, выделяемых из чистых помещений ¹⁰. Повсеместность распространения микроорганизма само по себе не обязательно является критерием для включения его в список тест штаммов. Скептики могут возразить, что вид Staphylococcus уже рекомендован фармакопеей в качестве тест штамма, и на этом основании есть ли смысл включать другой кокковый микроорганизм, выделенный из чистого помещения? Однако за пределами вида разные семейства предъявляют разные требования, а виды Micrococcus обладают способностью выживать в течение длительных периодов времени в чистых помещениях. Как заметил Бэйрд-Паркер еще в 1963 году, микрококки являются сапрофитами, которые менее требовательны к питанию и более изменчивы морфологически и биохимически, чем стафилококки ¹² (на основании трудов Бэйрд-Паркера микрококки были выделены в самостоятельный от стафилококков род – примечание переводчика).

Расширения списка тест штаммов имеет смысл с точки зрения улучшения репрезентативности, должно ли это расширение идти за счет домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды? Аргумент, используемый сторонниками этой идеи, связан с ожиданием, что домашние штаммы, изолированные из определенной экологической ниши, покажут иные характеристики роста, скорости роста, культуральные свойства, по сравнению с штаммами поддерживаемыми на лабораторных питательных средах. Чтобы рассмотреть этот вопрос детальнее, нам нужно рассмотреть культивируемость и экологические стресс факторы.

Термин «жизнеспособный, но некультивируемый» хорошо известен ¹³ ¹⁴ в среде микробиологов. То, что в окружающей среде существуют микроорганизмы, которые нельзя выращивать на питательных средах, известно благодаря применению молекулярно генетических методов. Такие методы предоставляют информацию о генетическом разнообразии микроорганизмов ¹⁵ и предполагают, что в мире больше тех, кто не поддается культивированию, чем микроорганизмов, способных расти на питательных средах в лаборатории¹⁶ ¹⁷. Это, кстати, свидетельствует о том, почему в чистых помещениях поддержание контролируемого состояния производственной среды всегда будет важнее, чем простое проведение производственного мониторинга. Ситуации, когда организмы сохраняют свою жизнеспособность, но не могут расти на лабораторных средах, могут быть вызваны тремя причинами. Во-первых, еще не была (или не может быть) разработана питательная среда, позволяющая их культивировать ¹⁸. Во-вторых, микроорганизмы могут быть культивируемыми, но используемая питательная среда или выбранные параметры инкубации не способствуют их росту ¹⁹.

В-третьих, организмы могут быть культивируемыми при наборе условий, но из-за активности некоторого «стресс фактора», их рост невозможен или замедлен. Стресс факторы могут включать: условия окружающей среды, такие как экстремальные температуры, голодание/недостаток питательных веществ, изменения pH, осмотический стресс, активные формы кислорода, воздействие консервантов, дезинфицирующих средств или радиации. Многие из перечисленных стресс факторов особенно типичны для чистых помещений. Реакция на стресс факторы может вызвать образование спор у некоторых ²⁰ и стратегию низкого потребления энергии или покоя у других, когда клетки остаются метаболически активными, но не делятся ²¹⁻²³. В других случаях рост может происходить, но требуется длительное время из-за фенотипических изменений. Это может проводить к изменению размера клеток ²⁴.

Присутствие стресс факторов, это обычное явление для таких фармацевтические обьектов контроля, как системы водоснабжения и чистые помещения. Микроорганизмы, сталкивающиеся с неоптимальными условиями, будут адаптироваться и перераспределять энергию для поддержания гомеостаза при дефиците ресурсов ²⁵. Некоторые таксоны обладают гибкостью для образования АТФ с использованием различных комбинаций акцепторов и доноров электронов, тогда как другие организмы специализируются на усвоении уникальных субстратов или сохранении энергии путем приостановки своей метаболической активности ²⁶ ²⁷. Другие бактерии, такие как как сапрофитные, могут питаться мертвыми клетками для удовлетворения своих метаболических потребностей и поддержки ограниченного клеточного деления (так называемая «рециркуляция некромассы») ²⁸ ²⁹.

Все эти факторы безусловно оказывают влияние на разнообразие небольших популяций микроорганизмов ³⁰. Такие условия также могут привести к ускорению популяционных мутаций ³¹ ³², причем более длительное голодание приводит к наибольшему числу генетических и фенотипических изменений ³³, а также к появлению большего количества штаммов, несущих мутации, которые увеличивают или уменьшают частоту персистеров (спящих клеток) ³⁴.

Анализ производственных изолятов

Установлено, что организмы будут проявлять фенотипические вариации в различных условиях окружающей среды. Сторонники включения домашних штаммов производственной среды в микробиологические испытания утверждают, что специфические реакции на стресс и механизмы выживания, приводят к различным паттернам роста ³⁵ ³⁶.В условиях стресса некоторые микроорганизмы могут показывать устойчивое отсутствие роста, вызванное недостаточной продолжительностью инкубации.³⁷Подобные адаптации становятся весовым аргументом в пользу включения домашних штаммов (локальных изолятов) в стандартные протоколы исследований и, на основе накопленных данных, увеличения времени инкубации для получения достаточного визуального роста на чашке ³⁸. Время играет большое значение, не только от момента начала инкубации, но и времени анализа/отбора, когда происходит перенос микроорганизма из места обитания на питательную среду, поскольку существует момент, после которого воспроизводимость микроорганизма уже невозможно. Выживаемость специфична для каждого таксона ³⁹. Требуется ли более длительная инкубация для воспроизводимости производственных изолятов? В фармацевтических исследованиях найдется мало статей, изучающих рост и выделение домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды. Тем не менее, исследования изучали кривые выживаемости различных экологических ниш (мест обитания) и показатели воспроизводимости в условиях лаборатории⁴⁰. Например, исследование темпов роста изолятов Pseudomonas aeruginosa из различных экологических ниш (включая реки и частные дома) показало высокое различие темпов роста на питательных средах между выделенными изолятами ⁴¹. Следовательно, время, необходимое для инкубации, зависит от вида микроорганизма и его физиологического состояния. Однако такие выводы были отмечены не всеми исследователями, а другие исследования показали быструю адаптивность и быструю потерю любых характеристик дикого типа ⁴² ⁴³. Микроорганизмы по-разному реагируют на факторы окружающей среды, эти реакции оказывают влияние на метаболические процессы, и могут являться триггерами для вывода микроорганизма из состояния покоя.

Проблема исследователя

Факторы перечисленные выше вынуждают задаться вопросами: «как долго следует инкубировать микроорганизмы на питательной среде?» и «требуют ли домашние штаммы (локальные изоляты) более длительного времени инкубации по сравнению с фармакопеей?» Если в ходе валидации можно показать, что скорости роста микроорганизмов схожи, то необходимость специально включать домашние штаммы (локальные изоляты) производственной среды теряет актуальность, но аргументы в пользу расширения списка тест штаммов остаются.

В то же время, если обнаружено что рост домашнего штамма требует более длительного времени инкубации, то необходимость его включения становится более чем актуальна. Если происходит подобное, то скорее всего, объясняется длительностью лаг фазы, происходящей до начала экспоненциального роста.

Также может быть, что конкретному микроорганизму необходима более длительная инкубация (по сравнению с описанной в фармакопеи) для обеспечения воспроизводимости. В качестве альтернативы может потребоваться введение этапа роста микроорганизма на обогащенной среде, но это усложняет работу с таким домашним штаммом.

Работу по домашним штаммам (локальным изолятам) производственной среды необходимо проводить на основании всесторонней оценки и исследований его роста, условий среды и оценки стресс факторов, такие работы индивидуальны для каждого производственного предприятия.

Вывод

Эта статья была написана с целью стимулирования обсуждение данной темы. Цель состояла в том, чтобы взвесить аргументы за и против использования домашних штаммов (локальных изолятов) на фармацевтических предприятиях. Для освещения аргументации обеих сторон были приведены ссылки на соответствующую литературу.

Список тест штаммов, используемых в микробиологических лабораториях фармацевтических предприятий, должен быть более репрезентативным, дабы доказать робастность применяемых методик. Вопрос остается лишь в том, должен ли этот список быть расширен за счет домашних штаммов или штаммов из утвержденных коллекций культур микроорганизмов, и насколько вообще это имеет значение?

#pharma

#microbiology

#bacteria

#wildtype

#тимсэндел

#микробиология

#фарма

#дикиештаммы

#методики

#фарманализ

Использование перекиси водорода: почему цикл деконтаминации может быть неуспешен?

2025-06-17T08:27:50.913Z

Перевод презентации Тим Сэнделл «WHY HYDROGEN PEROXIDE DECONTAMINATION CYCLES CAN FAIL?» March 21, 2025

Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина

Oxidative stress in bacteria

*Статья переведена c целью предоставить чек-лист возможных причин возникновения проблем при проведении циклов деконтаминации с использованием перекиси водорода для сотрудников лабораторий и фармацевтических производств

Целью использования перекиси водорода для проведения циклов деконтаминации в изоляторах и/или RABS (RABS (Restricted Acess Barrier System) – барьерные системы ограниченного доступа*) является достижения 6 log снижения численности микробиологической нагрузки. Методы достижения подразделяются на:

- Использование паров концентрированной перекиси водорода (30-35%)

- Деконтаминации перекисью водорода в виде аэрозольного распыления. В таком случае используется перекись меньшей концентрации, которая дополнительно ионизируется.

Что такое перекись водорода?

Перекись водорода – прозрачная жидкость, немного более вязкая чем вода, состоящая из молекул, соединенных кислородными связями и действующая как сильный окислитель.

Как перекись водорода убивает микроорганизмы?

Перекись водорода взаимодействует с компонентами клеточной стенки микроорганизмов, производя гидроксильные и гидропероксидные радикалы, которые атакуют и разрушают ее. Разрушение микробных клеточных белков приводит клетку к гибели.

Преимущества и ограничения перекиси водорода в качестве агента деконтаминации

- Не токсичные продукты распада (вода и кислород)

- Быстрая и легкая очистка оборудования и поверхностей от продуктов распада

- Высокая совместимость с материалами, обычно используемыми в технологических зонах

- Низкая и доступная цена

Ограничения:

- Не проникает внутрь материалов и не способна деконтаминировать в толще поверхностей (щели, трещины)

Критические параметры процесса успешной деконтаминации

- Концентрация

- Время воздействия

- Насыщение парами (Зависит от температуры и влажности)

- Дополнительный параметры такие как скорость потока, относительная влажность и объём загрузки камеры

Оптимизация процесса:

- Определить воздушные потоки и объём инъекции перекиси водорода

- Изменять условия: увеличить концентрацию перекиси водорода, работать при более высоких уровнях влажности для более быстрой микробной инактивации

- Оценивать наихудшие условия проведения деконтаминации

Почему цикл деконтаминации может быть не успешным

Форма материалов

• Для эффективной дезинфекции материалы (камеры и/или загружаемые) должны быть относительно гладкими, не проницаемыми для влаги, а их форма допускать максимальное соприкосновение с перекисью водорода. Форма материалов так же влияет на эффективность и распределение воздушного потока в камере, затрагивая продолжительность цикла. Обязательно документируйте количество и расположение материалов внутри камеры (загрузку) и следите за ее соблюдением.

• Поверхности материалов должны быть нейтральны к перекиси водорода и не вступать в химические взаимодействия, чтобы не снижать концентрацию последней.

• Подвешивайте материалы внутри камеры для увеличения площади их обработки, следите за концентрацией и временем экспозиции перекиси водорода внутри камеры.

• Неправильно упакованные и сложенные расходные материалы могут препятствовать их успешной деконтаминации.

• Необходимо визуально оценивать закрытые поверхности внутри камеры (и загрузки) и не ориентироваться только на распределение воздушного потока.

Температура, влажность и воздушные потоки

• Высокая температура может ускорить распад перекиси водорода, снижая концентрацию и эффективность цикла деконтаминации.

• Температура внутри камеры может быть разной в разных ее точках (что особенно актуально для маленьких камер).

• Низкая влажность снижает уровень насыщения паром, и скорость микробной инактивации.

• Распределение и скорость воздушных потоков, скорость работы вентилятора, положения заслонок и калибровка оборудования на прямую влияют на распределение паров внутри камеры и эффективность деконтаминации.

Чистота

• Для эффективной деконтаминации перекисью водорода поверхности должны быть очищены, так как грязь и загрязнения препятствуют действию перекиси водорода.

Микроорганизмы

• Существует список устойчивых к воздействию перекиси водорода микроорганизмов, величина D-value отражает время необходимое микроорганизму для достижения 90% гибели его клеток. Чем больше величина, тем большими механизмами устойчивости обладает микроорганизм, локальные штаммы могут обладать гораздо большей устойчивостью чем используемые для контроля циклов штаммы биоиндикаторов:

Микроорганизм / D-value, мин

Bacillus subtilis 7,3

Bacillus huringiensis 2,9

Bacillus subtilis var. globigii 2,0

Bacillus coagulans 1,8

Geobacillus stearothermophilus 1,5

Clostridium sp. putrefactive 0,8

Staphylococcus aureus 0,2

Биологические индикаторы

• Используемые биологические индикаторы нуждаются в проверки их чистоты и необходимого микробиологического числа, для проведения валидной проверки циклов деконтаминации. Определение этих параметров возможно только при использовании надежной методики.

• Форма выпуска коммерческих биоиндикаторов так же имеет значение, следует избегать тест полосок в силу наличия скрытых пор и проблем проникновения перекиси водорода. Предпочтение следует отдавать биоиндикаторам, выпускаемым в виде дисков из нержавеющей стали или стекла. Следует оценить точки закладки биоиндикаторов, с точки зрения беспрепятственного распределения воздушного потока вокруг них.

Качество перекиси водорода

• При возникновении проблем стоит обратить внимание на чистоту и концентрацию раствора перекиси водорода.

Другое

• Всегда оценивайте вносимые изменения на предмет их влияния на эффективность циклов деконтаминации. Запускайте несколько циклов деконтаминации для подтверждения их робастности и эффективности.

*примечание переводчика

#vhp

#asepticmanufacturing

#microbiology

#микробиология

#фарма

#перекисьводорода

#производство

#тимсэндел