Оптическая микроскопия. Часть 2.

Часть 1. Про классический световой микроскоп

Развитием идеи окрашивания образца при медико-биологических исследованиях стала флуоресцентная микроскопия. В ее основе лежит явление флуоресценции - способность некоторых веществ (флуорофоров) светиться под воздействием падающего света другого цвета.

Для понимания сути метода необходимо совершить небольшой экскурс во взаимодействие света и вещества с точки зрения квантовой механики. Свет представляет собой поток элементарных частиц – фотонов. При попадании фотона в молекулу свет поглощается (обычно электроном), затем какое-то время энергия хранится поглотившей частицей, а потом может выполниться один из следующих сценариев:

1. Энергия распределяется по всей молекуле, а затем передается и соседним, т.е. переходит в тепло (поглощение света)

2. Фотон и��лучается точно с такой же энергией (прохождение без искажения, отражение, рассеяние)

3. Часть энергии поглощенного фотона излучается (тогда излученный свет становится другого цвета), а часть – уходит в тепло. Это и есть эффект флуоресценции.

4. Электрон не успевает избавиться от энергии, как ему прилетает еще один фотон. Он может как выбить свою копию из электрона (если у того достаточно энергии), так и поглотиться (с намного меньшей вероятностью), после чего возникают странные эффекты, которые изучает нелинейная оптика, но сейчас не об этом.

В общем случае, суть флуоресцентной микроскопии выглядит следующим образом: к образцу добавляют немного химии, которая оседает на исследуемых структурах. Схема микроскопа чуть модифицирована относительно классической и включает в себя дополнительный осветитель (обычно лазер ) и фильтр, чтобы он не засвечивал картинку. Лазер светит, нужные области образца светятся в ответ, это регистрируется на камеру, вот и всё. В результате, могут быть получены фантастические по красоте картинки, которые сразу же выдаются гуглом при запросе «флуоресцентная микроскопия».

Флуоресцентная микроскопия образца конца ХХ века недалеко ушла от обычной окраски образца, но ее нынешнее состояние поражает воображение. Несколько лет химических исследований, и обычный флуорофор, светящийся при любых условиях, заменяется на флуоресцентные зонды. Они светятся только при соединении с определенными белками внутри клетки, которые образуются при строго определенных условиях.

Флуоресцентные зонды позволяют реализовать нечто вроде лампочки-индикатора, отражающей интенсивность наблюдаемых процессов. Клетка начала какую-то активность – зонды соединились с продуктами активности и начали светиться. На картинке вспыхнул «костер». Клетка замедлила синтез – стала менее яркой. Синтез окончился – клетка пропала из поля зрения. И это регистрируется в реальном времени. Пример передачи сигнала нейронами:

Самым известным ответвлением флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия. Снимаются несколько «срезов» образца, при этом образцы никто не режет, эффект среза достигается за счет использования специальных объективов и сверхточной системы фокусировки, после чего из подборки срезов, путем несложных математических преобразований™ формируется трехмерная модель образца. Примеры таких моделей можно посмотреть на видео ниже.

Другим известным методом флуоресцентной микроскопии является STED-микроскопия (Stimulated Emission Depletion Microscopy), разработчик которой в 2014 году был удостоен Нобелевской премии. В оптической микроскопии существует так называемый дифракционный предел – минимальный размер светящейся точки, изображение которой может получиться четким. Метод STED шагает за его предел очень оригинальным способом. Кроме лазера, вызывающего флуоресценцию, картинку освещает второй лазер, гасящий флуоресценцию во всем образце, кроме маленького круга, который и регистрируется камерой. Луч гасящего лазера перемещается по образцу, в результате чего записывается серия картинок со светящимися кружочками из которых, опять же путем несложных математических преобразований™, реконструируется изображение. Этот и аналогичные методы позволяют заглянуть в запчасти, из которых состоят органеллы клеток, вплоть до изучения отдельных групп молекул.

В отличии от классической оптической микроскопии, работающей с окрашенными образцами, флуоресцентная микроскопия не получила такого массового распространения. Это обусловлено большой трудозатратностью приготовления препаратов, да и общей дороговизной метода. Несмотря на это, флуоресцентная микроскопия заняла место одного из ключевых методов в клеточных научных исследованиях и вошла в практику в богатых мед. учреждениях.

Eshu Marabo