Комплексный анализ молекулярных атласов выявил модули, определяющие подтипы развивающихся клеток в коре головного мозга человека

Авторы: Патриция Р. Нано, Элиза Фаззари, Дарья Азизад, Антони Мартия, Клаудия В. Нгуен, Шон Ванг, Ванна Джианг, Райан Л. Кан, Джуюн Ю, Бритни Уик, Максимилиан Хаусслер и Апарна Бхадури.

Публикация: Nature Neuroscience, том 28, страницы 949-963 (2025)

Реферат

Развитие человеческого мозга требует создания разнообразных типов клеток, процесс, исследуемый одноклеточной транскриптомикой. С помощью параллельных метаанализов коры головного мозга человека в развитии (семь наборов данных) и во взрослом возрасте (16 наборов данных) мы создали более 500 сетей коэкспрессии генов, которые могут описывать механизмы развития коры, сосредоточившись на пиковых стадиях нейрогенеза. Эти метамодули демонстрируют динамическую специфичность подтипов клеток на протяжении всего развития коры, при этом несколько метамодулей развития демонстрируют пространственно-временные паттерны экспрессии, которые намекают на потенциальные роли в определении спецификации клеток. Мы подтвердили экспрессию этих модулей в первичных тканях коры головного мозга человека. К ним относится метамодуль 20, модуль, повышенный в нейронах глубокого слоя FEZF2+, который включает TSHZ3, фактор транскрипции, связанный с нарушениями нейроразвития. Эксперименты с химероидами коры головного мозга человека подтвердили, что как FEZF2, так и TSHZ3 необходимы для управления активностью модуля 20 и спецификации нейронов глубокого слоя, но через различные модальности. Эти исследования демонстрируют, как метаатласы могут способствовать дальнейшему механистическому анализу определения спецификаций участков коры.

Основное

Кора головного мозга человека, увеличенная по сравнению с грызунами и другими млекопитающими, обеспечивает различные биологические процессы, которые отличают человека от других видов, включая суждение, восприятие и речь. Многие из этих различий проявляются еще в процессе развития, а сигнальные пути и типы клеток, которые способствуют увеличению размера и функций коры головного мозга у людей, также создают уязвимость к различным нарушениям развития нервной системы и нервно-психическим расстройствам. Таким образом, изучение развития человеческого мозга имеет решающее значение для понимания типов клеток взрослого человека, их функций и заболеваний.

Существующие усилия по разделению клеток развивающегося мозга на типы в значительной степени опираются на маркерные гены, которые успешно определяют типы и подтипы клеток, но, возможно, не полностью охватывают диапазон генных программ, представленных в ходе такого сложного процесса, как развитие. Механистические исследования этих маркерных генов позволили установить основополагающие принципы определения специализации клеток коры головного мозга; однако одних этих генов недостаточно для определения типов развивающихся клеток, существующих в континууме, где несколько маркерных генов могут совместно экспрессироваться в одной и той же клетке. Детальная, полная и непредвзятая картина генных сетей, определяющих тип клеток, может выявить появление биологических функций в наборах данных о развитии. Таким образом, объединение возможностей нескольких наборов данных и использование дополнительных методов определения их идентичности необходимы для описания клеточного разнообразия в развитии коры головного мозга человека.

Значение инвентаризации типов и состояний клеток, которые участвуют в развитии человеческого мозга, было хорошо оценено в ходе работы в рамках инициативы BRAIN Initiative Cell Census Network, Human Cell Atlas и отдельных лабораторий, в результате чего за последние несколько лет были созданы многочисленные наборы данных о секвенировании одноклеточной РНК, которые сосредоточены на каталогизации типов клеток. Несмотря на важность этих ресурсов, каждое исследование ограничено реалиями редких выборок: ни в одном исследовании еще не было всестороннего профиля всех областей или стадий коры головного мозга с достаточным количеством выборок, чтобы вселить уверенность в том, что работа по составлению атласа завершена.

Методы коэкспрессии генов исторически использовались в исследованиях массового секвенирования РНК для получения уникального представления о генных модулях, которые объясняют ключевые механизмы развития заболеваний, а в последнее время они находят применение в данных об отдельных клетках. В текущем исследовании авторы применили стратегию совместной экспрессии генов из метамодулей, основанную на итеративной иерархической кластеризации, для интеграции недавно опубликованных одноклеточных транскриптомных профилей коры головного мозга на стадии развития и во взрослом возрасте с целью выделения генных сетей, которые описывают не только тип клеток, но и ключевые процессы развития и признаки созревания. Чтобы сосредоточить свои усилия на генных сетях, определяющих типы клеток коры головного мозга, коллекция данных о развитии была сосредоточена на стадиях пикового нейрогенеза, а также на переходе от нейрогенеза к глиогенезу. Эти временные точки позволяют аналитикам определить, когда радиальная глия, нервные стволовые клетки коры головного мозга, подразделяются на несколько подтипов и дают начало подавляющему большинству популяций клеток в коре головного мозга.

Используя эту стратегию, авторы выявили сети, имеющие отношение к переходу от нейрогенеза к глиогенезу и формированию специфических подтипов нейронов, обнаруженных в мозге взрослого человека. Авторы использовали иммуноокрашивание для проверки типа клеток и временных паттернов активности ключевых метамодулей в первичной развивающейся коре головного мозга человека. Кроме того, авторы функционально исследовали метамодуль, связанный с глубокими слоями, используя кортикальные химероиды человека – недавно описанную модель развивающейся коры головного мозга человека, в которой кортикальные органоиды генерируются путем объединения нескольких линий плюрипотентных стволовых клеток. Эксперименты на трех линиях доноров продемонстрировали способность незначительных различий в активности метамодулей приводить к резким изменениям в типовом составе клеток. Эти генные сети представляют собой разнообразный набор процессов развития, включающий ресурс, применимый к широкому кругу вопросов, касающихся развития человеческой коры. Результаты авторов также свидетельствуют о том, что стратегия создания мета-атласа может быть использована для получения биологической информации в рамках усилий по созданию атласов, которые по-прежнему занимают центральное место в этой области.

Результаты

Идентификация генных сетей в мета-атласе с помощью итеративной кластеризации

Созданный авторами мета-атлас развивающейся коры головного мозга человека включает семь недавно опубликованных наборов одноклеточных транскриптомных данных, содержащих 599 221 клетку от 96 индивидуумов, охватывающих 6-40 недель беременности и 8 месяцев после рождения. Сначала авторы провели тщательный контроль качества и совместную кластеризацию набора данных с использованием разработанного конвейера взаимного анализа главных компонентов (PCA), чтобы установить, что ожидаемые типы клеток и опубликованные маркерные гены могут быть четко идентифицированы, что позволяет визуализировать и проверять входные наборы данных. Мета-атлас содержит ожидаемое распределение типов и подтипов клеток, экспрессирующих соответствующие маркерные гены.

Авторский интеграционный анализ, а также параллельные альтернативные подходы, вселяют уверенность в целостность большого набора данных мета-атласа, а анализы псевдовремени подтверждают способность авторов продемонстрировать, что данная интеграция показывает континуум состояний клеток. Однако технические различия между исследованиями могут скрывать важные биологические процессы, подчеркивая необходимость модульного анализа для дальнейшего изучения динамических процессов развития.

Чтобы использовать эти данные для выделения генных сетей, которые эффективно описывают развитие коры головного мозга человека, авторы провели метамодульный анализ. Сначала они определили ключевые источники транскриптомных вариаций у каждого человека в наборе данных, сгруппировав клетки для каждого человека и идентифицировав кластерные гены-маркеры. Затем они оценили способность каждого маркерного гена описывать кластер, используя показатель, основанный на специфичности и степени обогащения экспрессии маркерного гена в назначенном ему кластере.

После этого, авторы определили гены, которые связаны не только внутри клеток одного и того же индивидуума, но и между наборами данных и во всем мета-атласе. Они объединили кластерные маркеры всех индивидуумов в мета-атласе и выделили маркерные гены, которые превысили 90-й процентиль показателей генов по всему мета-атласу. Это позволило сгенерировать отфильтрованный список кластерных маркеров, наиболее репрезентативных для транскрипционных сигнатур, обнаруженных у каждого индивидуума, которые затем были иерархически сгруппированы в метамодули. Таким образом, было сгенерировано 225 метамодулей, состоящих из генов, которые совместно экспрессируются для разных людей, наборов данных и возрастов - генов, связь которых друг с другом не поддается техническому воздействию. Авторы наблюдали значительно более высокие корреляции экспрессии генов в модулях, что подтверждает их технический подход. Сравнив полученные метамодули с широко используемыми анализами коэкспрессии генов и регулонов, авторы обнаружили, что их подход объединяет гены в наборы почти совершенно уникальным образом. Поэтому они предположили, что метамодули обеспечивают стратегию ортогональной коэкспрессии для выявления биологических процессов, важных для развития коры головного мозга человека, идентифицированных совершенно беспристрастным образом.

Метамодули охватывают общие процессы и процессы, специфичные для конкретного типа клеток

Авторы изучили биологическую роль этих сетей путем подробного описания каждого метамодуля, размер которого варьировался от 10 до 471 гена. Изучив сигнальные пути, субклеточные локализации, факторы транскрипции (TF) и типы клеток, представленные в каждом метамодуле, а также проведя обзор литературы по генам метамодулей, они смогли отнести биологические процессы к большинству метамодулей. Эти функции охватывали широкий спектр, включая функцию синапсов, иммунную функцию, специализацию клеток и их деление.

Для проверки точности аннотаций, авторы сначала проверили, были ли метамодули, помеченные процессами, специфичными для конкретного типа клеток, более активными в ожидаемых типах клеток. В этих анализах клетки оценивались с использованием показателя активности метамодуля, основанного на средней экспрессии генов в метамодуле, аналогично другим опубликованным методам. Был обнаружено, что активность метамодулей, отвечающих за сосудистую или иммунную активность, была повышена в эндотелиальных и микроглиальных кластерах соответственно. Аналогичным образом, некоторые метамодули, связанные с функциями олигодендроцитов и астроглии, были специфичны для этих типов клеток.

Для более систематического изучения специфики типов клеток в метамодулях, авторы разработали показатель специфичности модуля, который измеряет, насколько модуль обогащен определенным типом клеток или подтипом. Авторы заметили, что развивающиеся типы клеток характеризуются группами модулей, а не отдельными высокоспецифичными модулями, предполагая, что в процессе развития отдельные модули могут совместно использоваться несколькими типами клеток, и каждый тип клеток отличается уникальной комбинацией модулей.

Мета-атлас данных по взрослым показывает динамику сигнатур клеточной специализации

Чтобы оценить, насколько хорошо метамодули, полученные на основе данных о развивающейся коре, могут объяснить типы клеток взрослого человека, авторы стремились связать модули между развивающейся корой и корой взрослого человека. Чтобы достичь этого, они создали параллельный метаатлас из 16 недавно опубликованных транскрипционных наборов данных из мозга взрослого человека, который состоит из 2,6 миллионов клеток у 274 человек в возрасте 25 лет и старше. Они создали единообразную аппроксимацию и проекцию многообразия (UMAP) для визуализации и аннотировали типы клеток взрослого человека, сопоставив широкие и детальные аннотации из одного из наборов данных, составляющих этот метаатлас. Это привело к созданию аналогичного количества метамодулей, как и в случае сгенерированных метаатласом стадии развития (299 метамодулей), вселяя уверенность в том, что авторские принципы метаатласа развития перекрестно применимы к новым, существенно более крупным наборам данных.

Как и в случае развития, авторы использовали оценку специфичности модулей, чтобы проанализировать, как эти модули распределены среди типов взрослых клеток. В отличие от стадии развития, авторы заметили, что взрослые подтипы в основном характеризовались одним или двумя поразительно специфическими взрослыми модулями. Учитывая это несоответствие, они попытались выяснить, обусловлены ли данные тенденции различиями между модулями или между типами клеток в развитии и взрослости. Таким образом, были проведены обратные анализы, в которых взрослые модули анализировались по типам клеток развития, а модули развития оценивались по типам взрослых клеток. Этот анализ убедительно показал, что независимо от того, какой набор модулей оценивается, типы клеток стадии развития выражают более широкий спектр модулей с большей специфичностью, тогда как типы взрослых клеток более ограничены в своей экспрессии модулей. Это естественно привело к вопросу о том, как программы генов изменяются или совершенствуются от развития к взрослости. Авторы напрямую сравнили состав модулей между взрослым и развивающимся мозгом, отметив, что, хотя многие взрослые модули имеют значительное совпадение с модулями стадии развития, две коллекции модулей в целом представляют собой уникальные группировки генов. Среди нейронных популяций в своем мета-атласе развития авторы заметили, что более поздние подтипы, такие как нейроны верхнего слоя, характеризовались большим соотношением взрослых модулей по сравнению со стадией развития. Авторы стремились более широко изучить эту тенденцию, исследуя, как модули, специфичные для подтипов клеток у взрослых, могут быть связаны с подтипами клеток на стадии развития. Они также исследовали обратную ситуацию, анализируя, как модули, специфичные для подтипов развития, могут характеризовать подтипы у взрослых. В целом, большинство модулей, специфичных для подтипов возбуждающих нейронов у взрослых, маркируют возбуждающие нейроны и на стадии развития. Однако, при сопоставлении этих специфичных для подтипов модулей с отдельными подтипами возбуждающих нейронов, было обнаружено, что модули, маркирующие подтипы возбуждающих нейронов у взрослых, восходят к различным подтипам на стадии развития, что указывает на наличие транскриптомного уточнения на уровне подтипа клеток. Проведя этот взаимный анализ, авторы также подтвердили, что модули, специфичные для определенных подтипов стадии развития, являются репрезентативными для широкого спектра подтипов взрослых клеток, особенно среди клеток-предшественников на стадии развития. Заинтригованные этими тенденциями, авторы более подробно изучили модули, специфичные для предшественников во время развития. Как и ожидалось, большинство этих модулей (40–60%) специфичны для астроцитов у взрослых. Однако было обнаружено, что модули стадии развития и взрослые модули, специфичные для клеток-предшественников на стадии развития, могут отмечать различные наборы типов нейронных клеток у взрослых. В одном интересном примере 6% модулей, специфичных для радиальной глии во время развития, были наиболее специфичны для тормозных нейронов у взрослых, но модули стадии развития отмечали иные подтипы тормозных нейронов, чем взрослые модули. Это согласуется с недавней работой, в которой наблюдалось локальное дорсальное поколение тормозных нейронов между 15 и 18 неделями беременности. Дальнейшее изучение набора данных таким образом может выявить другие генные программы, которые могут намекать на уточнение специализации предшественников в сторону взрослых подтипов.

Предыдущие исследования развития коры головного мозга человека отметили большие различия в типах клеток и программах экспрессии генов между временными точками развивающегося мозга и мозгом взрослого человека, при этом существенные изменения в экспрессии генов происходили между пиком нейрогенеза и ранним детским периодом. Таким образом, сравнительные мета-атласные подходы авторов подтвердили давние наблюдения: подтипы клеток на стадии развития отличаются тонкими транскриптомными различиями, которые усиливаются в коре головного мозга взрослого человека. Это позволяет сделать предположение о том, что для расшифровки программ, управляющих определением специализации клеток, важно рассматривать эти процессы с точки зрения развития.

Метамодули раскрывают генные программы, инициирующие судьбу клетки

Идея о том, что динамика активности модуля в клетках-предшественниках в период развития может служить основой для анализа спецификации типа кортикальных клеток, особенно наглядно иллюстрируется метамодулем 156. Задача облегчается с помощью авторской метамодульной метрики активности, которая позволяет сравнивать метамодули из мета-атласа стадии развития с мета-атласом для взрослых. Кроме того, метрика активности модуля позволяет оценивать модули во внешних наборах данных, охватывающих другие моменты времени. Эти наборы данных обеспечивают дальнейшую проверку моделей активности модулей, наблюдаемых в мета-атласе стадии развития, а также предоставляют набор данных, позволяющий определить, как модули меняются с течением времени, не включенного в атласы.

В мета-атласе стадии развития активность модуля 156 особенно высока в клетках-предшественниках и становится более активной в радиальной глии на протяжении всего процесса развития. Эти паттерны были воспроизведены в периоды второго триместра для других кортикальных профилей развития, а также для клеток-предшественников радиальной глии, начиная с третьего триместра и заканчивая подростковым возрастом. Метамодуль 156 также специфичен для радиальной глии, поскольку подтипы радиальной глии демонстрируют самые высокие показатели специфичности для этого модуля. Эти паттерны экспрессии модулей приводят к значительному ограничению модуля 156 глиальными подтипами в мета-атласе для взрослых, что видно как по активности модуля, так и по измерениям специфичности.

В соответствии с ролью метамодуля 156 в глиогенезе, аннотация генов модуля 156 указала на роль в биологии радиальной глии, нейронной активности и реакции на стимулы. Один из генов-членов метамодуля 156, QKI, выполняет роль панглиального маркера клеток-предшественников. Авторы дополнительно подтвердили эту модель, определив колокализацию генов метамодуля 156 в предшественниках желудочковой зоны (VZ) в первичной коре плода на 16 и 20 неделях беременности.

Сначала авторы сосредоточились на QKI и гене метамодуля 156 PDLIM5, постсинаптическом каркасном белке, играющем роль в развитии дендритных шипиков спинного мозга и нейропсихиатрических расстройствах, но не имевшем зарегистрированной роли в специализации клеток глии. Экспрессия как QKI, так и PDLIM5 наблюдалась уже на 16-й неделе беременности, наиболее заметно в промежуточной зоне (IZ) и VZ, при этом уровни QKI увеличивались по интенсивности на 20-й неделе беременности. Эти паттерны экспрессии демонстрировали частичную колокализацию в пределах VZ, в которой можно было увидеть точечное окрашивание PDLIM5 вокруг ядер QKI+. Для дальнейшей проверки модуля авторы также провели окрашивание на предмет коэкспрессии других генов модуля, включая SALL1, фактор транскрипции, который, согласно наблюдениям, локализуется совместно с QKI, как и предсказывалось модулем . Авторы также наблюдали колокализацию двух дополнительных частей модуля, ZFP36L1/2, который был описан как посредник перехода между нейронными предшественниками и глией как на стадии развития, так и при раке мозга и FOS. FOS — это ген раннего ответа, обычно связанный с нейронами, и его роль в клетках-предшественниках описана недостаточно хорошо, но конструкция метамодуля и иммуноокрашивание подтверждают, что он экспрессируется в зоне предшественников и что он локализуется совместно с другими генами модуля 156. Эти результаты дополнительно подтверждают модель, согласно которой метамодуль 156 может представлять собой генную программу, которая сигнализирует о переходе внутри клеток-предшественников от нейрогенеза к глиогенезу — процесс, который был хорошо связан со временем и подтипом клеток, но не был хорошо определен на молекулярном уровне. Интересно, что хотя модуль 156 содержит элементы с описанными ролями в глиогенезе (в частности, QKI и ZFP36L1/2), эти регуляторы не были сгруппированы вместе в установленных анализах, таких как анализы сетей взаимодействия STRING . Таким образом, модуль 156 демонстрирует, как авторский подход к генерации метамодуля может выявить связи между наборами генов, которые могут обеспечить ортогональное описание специализации клетки. Тем не менее, текущие результаты представляют собой гипотезы, основанные на наблюдаемой совместной экспрессии и прогнозируемом анализе взаимодействия белок-белок, хотя будущие работы могут экспериментально проверить это наблюдение.

Метамодули раскрывают генные программы, которые уточняют тип клеток

Затем авторы изучили способность метамодулей представлять принятие конкретных нейронных подтипов идентичности. Их анализы выявили три метамодуля, которые были активны в определенных возбуждающих нейронных подтипах в процессе развития. Они включают метамодули 189 (характеризующиеся смесью генов, связанных с индукцией нейрогенеза) и 94 (связанные с ионными каналами и синаптической сигнализацией), активные в нейронных подмножествах глубоких слоев. Авторы также оценили активность метамодуля 134, в первую очередь в возбуждающих нейронах GRIN2B и включающие гены, характеризующиеся ролью в синапсах. Для этого анализа они использовали данные одного из исследований в мета-атласе для взрослых, которые включали анализ слоев и секвенирование типов клеток, чтобы определить, как эти модули экспрессируются в слоях коры головного мозга взрослых. Все три метамодуля увеличивали активность с течением развития, при этом метамодуль 134 в нейронах новорожденных появился позже, чем два других. Чтобы связать эти метамодули с подтипами нейронов взрослых, авторы рассчитали баллы активности метамодулей в клетках коры взрослого человека. У взрослых метамодули были активны в более широком диапазоне типов клеток, но проявляли некоторую активность, специфичную для определенного слоя. Хотя метамодули 94 и 189 сохраняют свою специфичность к подтипам нейронов глубоких слоев в коре взрослого человека, метамодуль 134 становится специфически обогащенным в слое IV.

Учитывая, что активность метамодуля 134 повышена в слое IV коры головного мозга взрослого человека, авторы исследовали, может ли этот модуль сигнализировать о специфичности клеток слоя IV в развивающейся коре головного мозга человека. В кортикальной пластинке (CP) развивающейся коры головного мозга человека (на 16 и 20 неделе беременности) авторы обнаружили экспрессию двух элементов метамодуля 134, оба из которых имеют недостаточно изученные роли в развитии мозга: ADAM33, металлопротеаза с повышенной экспрессией в мозге согласно исследованиям на мышах, и HS6ST2, гепарансульфатсульфотрансфераза, связанная с глиомой и интеллектуальной инвалидностью из-за мутации Х-хромосомы. ADAM33 был обнаружен в цитоплазме и плазматической мембране клеток по всему CP, тогда как HS6ST2 был сконцентрирован в верхних слоях, особенно в клетках, расположенных над клетками, экспрессирующими маркер глубокого слоя CTIP2. На 20 неделе беременности клетки верхнего слоя также демонстрировали частичную совместную локализацию ADAM33 и HS6ST2, что было предсказано повышением активности метамодуля 134 в слое IV коры головного мозга взрослого человека.

Другой метамодуль, 144, был обнаружен как специфически активный в мета-атласе стадии развития, преимущественно в подтипах интернейронов, экспрессирующих холецистокинин (CCK), ген, кодирующий предшественник пептидных гормонов. Активность метамодулей в этих клетках также возрастает в процессе развития. При изучении активности метамодуля 144 в мозге взрослого человека авторы отметили, что она была повышена в слое I, который содержит специфические подтипы популяций тормозных нейронов. Поэтому они проверили предположение о том, что метамодуль 144 может указывать на спецификацию подтипов интернейронов. Метамодуль 144 включает SLC32A1, который кодирует везикулярные ГАМК-транспортеры VGAT, экспрессируемые почти исключительно в клетках CCK.TAC1.iN и CCK.VIP.iN. Этот модуль также содержит TF ZBTB16 (также известный как PLZF), который, что интересно, играет важную роль в толщине неокортекса, характеристике глубоких слоев и фенотипах развития нервной системы в коре головного мозга мыши. В соответствии с повышением активности метамодуля 144 в слое I коры головного мозга взрослого человека, VGAT, ZBTB16 и CCK были обнаружены в слое I коры головного мозга развивающегося плода на 16 неделе беременности, а клетки демонстрировали совместную экспрессию цитозольного ZBTB16 либо с VGAT+, либо с CCK+ пунктами. Эти результаты подтверждают модель, согласно которой метамодуль 144 может указывать на инициацию специализации клеток уровня I, CCK+ интернейронов.

Используя несколько метамодулей, авторы обнаружили, что можем проверить временные и пространственные паттерны экспрессии, предсказанные на основе имеющихся данных, сгруппировав ранее не связанные гены в метамодули. Таким образом, временная динамика метамодулей отражает ключевые изменения в идентификации будущей специализации клеток на протяжении всего процесса развития. Это позволяет предположить, что такой метамодульный анализ может стать объективным способом выявления ранее недоступных транскриптомных сдвигов, которые определяют специализацию клеток коры головного мозга человека.

Метамодуль 20 коррелирует с нейронами глубокого слоя FEZF2+

Чтобы продолжить изучение того, как метамодульный анализ может помочь в механистическом исследовании специализации клеток коры головного мозга, авторы сосредоточились на метамодуле 20. Активность метамодуля 20 неуклонно возрастает на протяжении всех этапов развития, описанных в атласе, и эта закономерность наиболее заметна в подтипах нейронов глубокого слоя. Интересно, что активность модуля 20 неизменно остается низкой в нейронах верхнего слоя и тормозных нейронах. Эти закономерности позволяют предположить, что модуль 20 может отражать специфические для подтипа или созревания сигнатуры возбуждающих нейронов, но провести различие между этими двумя возможностями с помощью мета-атласа стадии развития оказалось затруднительным, учитывая относительную незрелость нейронов верхнего слоя. Поэтому авторы исследовали активность модуля 20 в подтипах коры головного мозга взрослых, снова используя набор данных для взрослых, специфичных для каждого слоя. В коре головного мозга взрослого человека клетки с наибольшей экспрессией метамодуля 20 находятся почти исключительно в нейронах глубокого слоя. Более тщательное изучение этих клеток с метамодулем 20high выявило специфическое обогащение подтипами, ассоциированными с хорошо зарекомендовавшим себя терминальным фактором FEZF2, несмотря на то, что FEZF2 не является геном в модуле 20. Хотя FEZF2, как правило, редко встречается у взрослых, авторы наблюдали, что клетки глубокого слоя, аннотированные FEZF2, демонстрируют значительно более высокие уровни как FEZF2, так и модуля 20.

Таким образом, авторы предположили, что метамодуль 20 может представлять собой генную сеть, с помощью которой на ранних стадиях развития устанавливается идентичность взрослого подтипа FEZF2+. Во время беременности экспрессия FEZF2 предшествовала активности метамодуля 20, временно достигая максимума на 10-15 неделе беременности, и в значительной степени снижаясь к моменту пика активности метамодуля 20. Хотя экспрессия FEZF2 в подтипах нейронов глубокого слоя коры головного мозга человека хорошо изучена, подавляющее большинство механистических анализов функции Fezf2 было проведено на мышах. Поэтому авторы рассчитали активность метамодуля 20 в недавно опубликованных одноклеточных транскриптомных атласах коры головного мозга развивающихся и взрослых мышей и обнаружили, что активность этого модуля в коре головного мозга мыши менее ограничена, чем у человека. В развивающейся коре головного мозга мыши метамодуль 20 демонстрирует устойчивое повышение активности не только подтипов нейронов глубоких слоев, но и подтипов нейронов верхних слоев. Активность метамодуля 20 сохраняется в коре головного мозга взрослой мыши, причем активность наиболее высока среди подтипов нейронов глубокого слоя. Однако, в отличие от коры головного мозга человека, экспрессия метамодуля 20 и Fezf2 в этих подтипах больше не имеет тесной корреляции. Таким образом, метамодуль 20 может играть предполагаемую роль в реализации специализации нейронов глубокого слоя FEZF2+ в коре головного мозга человека, отличной от паттернов его экспрессии у мыши.

FEZF2 нацелен на гены метамодуля 20, включая TSHZ3

Авторы предположили, что, несмотря на то, что FEZF2 не является членом метамодуля 20, он индуцирует активацию метамодуля 20 в созревающих нейронах глубокого слоя. Чтобы исследовать эту модель, мы сравнили совпадение между генами метамодуля 20 и предполагаемыми мишенями Fezf2. Поразительно, что почти половина генов метамодуля 20 являются предполагаемыми мишенями Fezf2 (35 из 74 генов). Чтобы проверить, является ли метамодуль 20 связующим звеном между FEZF2 и полной спецификацией этих нейронов глубокого слоя, мы провели поиск TFs среди предполагаемых мишеней Fezf2 в метамодуле 20. В модуле 20 есть только один фактор транскрипции, TSHZ3, который недавно был связан с расстройством аутистического спектра. Предыдущие транскриптомные исследования выявили, что и TSHZ3, и FEZF2 являются членами неокортикальной генной сети, связанной с дифференцировкой нейронов, генерацией аксонов и нейронной проекцией, активность которых достигает максимума в период развития. В коре головного мозга мыши истощение Tshz3 приводило к изменению экспрессии нейрональных маркеров глубокого слоя, включая повышенную регуляцию Fezf2. Однако неясно, как эти факторы взаимодействуют друг с другом и с другими элементами метамодуля 20, определяя спциализацию клеток в процессе развития человеческого мозга. Чтобы исследовать роль TSHZ3 в связывании активности FEZF2 и метамодуля 20, мы сравнили временную динамику экспрессии TSHZ3 и модуля 20 во время разработки. Интересно, что TSHZ3 демонстрирует временную активацию на 15-21 неделях беременности, достигая максимума между пиками активации FEZF2 и метамодуля 20. Примечательно, что в коре головного мозга взрослого человека TSHZ3 широко экспрессируется, что потенциально указывает на временное ограничение его роли в определении нейронов глубокого слоя FEZF2+. Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить модель, в которой FEZF2 воздействует на нейроны глубокого слоя на ранних стадиях развития, активируя TSHZ3, тем самым вызывая активацию метамодуля 20, способствующего определению подтипов глубокого слоя FEZF2+, обнаруживаемых у взрослого человека.

Совместная локализация FEZF2/TSHZ3 в нейронах глубокого слоя человека

Чтобы подтвердить зависимость между типом клеток FEZF2 и TSHZ3 в развивающейся коре головного мозга человека, авторы исследовали экспрессию FEZF2 и TSHZ3 в срезах кортикальной ткани из образцов на 16 и 20 неделе беременности. Они обнаружили, что экспрессия гена FEZF2 в коре головного мозга является самой высокой во всей кортикальной пластинке, как и ожидалось, учитывая его хорошо зарекомендовавшую себя роль в определении идентичности нейронов глубокого слоя. На этой стадии TSHZ3 также экспрессировался совместно с FEZF2 во всей CP. Хотя уровни FEZF2 снизились до почти незаметных уровней на 20 неделе беременности, авторы обнаружили более выраженную экспрессию TSHZ3, особенно в нейронах глубокого слоя. В соответствии с этим и предыдущими отчетами, ядра TSHZ3+ были локализованы совместно с подмножеством ядер, экспрессирующих CTIP2, маркер подтипов нейронов слоя 5.

FEZF2, TSHZ3 и модуль 20 генерируют нейроны глубокого слоя

Затем авторы попытались оценить, необходим ли TSHZ3 для специализации нейронов глубокого слоя в контексте развития человеческого мозга. Они провели эксперименты с нокдауном (KD) на кортикальных органоидах – моделях развивающегося человеческого мозга, полученных из стволовых клеток, которые содержат основные популяции клеток коры, включая нейроны глубокого слоя. Чтобы добиться максимальной согласованности и свести к минимуму любые побочные эффекты, авторы использовали недавно описанный химероидный подход, который объединяет несколько линий плюрипотентных стволовых клеток после их спецификации в кортикальную идентичность. Три линии плюрипотентных стволовых клеток человека были впервые использованы для получения кортикальных органоидов по нашим стандартным протоколам, затем их разделили на одноклеточные суспензии и разделили на реагенты в присутствии лентивирусных конструкций, кодирующих флуоресцентный репортер и кшРНК, нацеленную на FEZF2, кшРНК, нацеленную на TSHZ3, или обе вместе для обеспечения двойной KD обоих генов. Чтобы подтвердить, что химероидный подход был успешным, авторы провели сортировку клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), для обогащения клеток зеленым флуоресцентным белком (GFP)+ (FEZF2 KD), mCherry+ (TSHZ3 KD) и GFP+/mCherry+ (2×-KD). Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT-PCR) подтвердила нокаут генов–мишеней в этих обогащенных популяциях, и авторы приступили к секвенированию одноклеточной РНК с использованием платформы мгновенного секвенирования с использованием шаблонов частиц (PIP-seq).

Многочисленные исследования, включая иммунофлуоресцентное определение CTIP2 (маркера глубокого слоя) и SOX2 (маркера-предшественника радиальной глии), а также содержание митохондрий при секвенировании и экспрессия предполагаемых маркерных генов, подтвердили работоспособность химероидов, что дало авторам уверенность в эффективности их подхода. Используя эталонные однонуклеотидные варианты, они демультиплексировали данные PIP-seq81, чтобы получить биологические копии по образцам в дополнение к техническим копиям по отсортированным образцам. Эти биологические копии позволили провести тщательный анализ нашего эксперимента с химероидами KD, и авторы наблюдали значительное снижение активности генов-мишеней, что соответствовало снижению активности метамодуля 20. Интересно, что эти анализы также показывают, что молекулы кшРНК FEZF2 также могут снижать экспрессию TSHZ3, что указывает на модель, в которой FEZF2 активирует модуль 20 частично через TSHZ3. Авторы аннотировали типы клеток в наборе данных, используя стратегии прогнозирования из мета-атласа стадии развития, отметив, что множественные состояния при KD изменяют соотношение типов клеток в глутаматергической линии. Эти изменения в соотношении типов клеток были наиболее заметными в условиях 2×KD, в которых уменьшение количества как нейронов глубокого слоя, так и промежуточных клеток-предшественников (IPC) сопровождалось увеличением радиальной глии. По сравнению с только FEZF2 или TSZH3 KD, состояние 2×-KD также индуцировало большее количество дифференциально экспрессируемых генов (DEG) как в клетках глубокого слоя, так и в клетках радиальной глии. Интересно, что 2×-KD увеличивали экспрессию генов, участвующих в синаптической функции, как в нейронах глубокого слоя, так и в клетках радиальной глии. Способность 2×-KD регулировать и значительно увеличивать популяции радиальной глии была дополнительно подтверждена с помощью иммуноокрашивания внешнего маркера радиальной глии HOPX у химероидов. Эти данные свидетельствуют о том, что истощение как FEZF2, так и TSHZ3 может препятствовать надлежащей дифференцировке радиальной глии в нейроны глубокого слоя, либо путем прекращения дифференцировки радиальной глии, либо путем смещения радиальной глии в сторону альтернативных состояний. В соответствии с этой гипотезой авторы наблюдали кластер клеток, уникальный для клеток 2×KD, который содержит генные сигнатуры, соответствующие смеси подтипов развивающихся нейронов, включая подтип глубокого слоя RYR2/ASIC2+. Хотя эта популяция отмечена генами, связанными со зрелыми нейрональными синапсами, авторы отмечают, что у нее нет четкого аналога во взрослом мета-атласе. В совокупности эти данные указывают на то, что FEZF2 и TSHZ3 играют роль в определении типа клеток глубокого слоя у человека посредством регуляции генов, определенных в модуле 20 при анализе мета-атласа.

Чтобы выяснить, как FEZF2 и TSHZ3 могут функционировать в генной регуляторной сети, авторы проанализировали влияние этих факторов транскрипции на доступность хроматина, используя одноклеточное мультиомное профилирование клеток, полученное с помощью нашего химероидного подхода. Они подтвердили, что эти образцы также демонстрировали четкую экспрессию всех трех исходных клеточных линий; снижение активности генов FEZF2, TSHZ3 и модуля 20; и истощение клеток глубокого слоя, как наблюдалось в проведенных транскриптомных экспериментах. Интересно, что эти эксперименты продемонстрировали, что молекулы кшРНК TSHZ3 обладают уникальной способностью снижать доступность промоторов FEZF2 и TSHZ3 и генного тела, а также среднюю доступность хроматина для генов модуля 20. Когда мы рассмотрели каждый отдельный ген модуля 20, истощение TSHZ3, но не FEZF2, значительно снизило доступность хроматина для большинства членов модуля. На уровне всего генома мы наблюдали, что TSHZ3 продолжает демонстрировать большую способность регулировать доступность хроматина, чем FEZF2: TSHZ3 необходим для обеспечения доступности хроматина для более чем 1000 генов, и эти мишени обогащены генами, связанными с синаптической активностью. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что комбинация FEZF2 и TSHZ3 опосредует правильное развитие радиальной глии в направлении развития глубоких слоев посредством активации генов модуля 20, при этом FEZF2 действует как активатор транскрипции, а TSHZ3 обеспечивает доступность хроматина.

Обсуждение

Результаты авторов демонстрируют, как их стратегия интегративного мета-атласа может пролить свет на сети экспрессии генов, которые определяют судьбу клеток от развития до взрослой жизни. Во всех тканях, но особенно в головном мозге, развитие происходит в виде организованной последовательности диверсификации типов клеток, при этом различные типы клеток, подтипы и траектории развития развиваются параллельно. Это приводит к появлению целого ряда состояний клеток, и, хотя эти состояния были отмечены экспрессией факторов транскрипции и других представляющих интерес генов, эти маркеры типа клеток не всегда связаны с тонкими биологическими процессами, которые определяют специализацию клетки. Авторы предлагают доступный для поиска ресурс из 225 метамодулей, которые характеризуют стадии пикового нейрогенеза в развивающемся человеческом мозге, и 299 модулей, которые описывают типы клеток коры головного мозга взрослого человека. Эти два мета-атласа и соответствующие им метамодули показывают, как транскрипционные программы, которые характеризуют подтипы клеток во время развития, расходятся во взрослом мозге, что согласуется с предыдущими сообщениями об обширной перестройке транскрипции во время развития в третьем триместре и в детском возрасте. Таким образом, наши результаты дают дополнительную поддержку для изучения траекторий развития подтипов клеток с точки зрения, основанной на данных о развитии, а не на данных о взрослом организме, где транскрипционный ландшафт существенно изменен и отличается от процессов развития.

Наши метамодули облегчают такой анализ, включая идентификацию и функциональный опрос метамодуля 20, связанного с глубокими слоями. Основные принципы определения этих подтипов нейронов, в частности, с помощью терминального фактора дифференцировки Fezf2, были выяснены в ходе исследований на грызунах, но роль других факторов транскрипции или дополнительных генных сетей в определении идентичности этого подтипа полностью не охарактеризована. Интересно, что взаимосвязь между метамодулем 20, Tshz3 и Fezf2 при определении подтипа не была точно сохранена у мыши, поскольку как метамодуль 20, так и Tshz3 были более широко выражены в данных мыши, чем у человека. Используя преимущества последних химероидных моделей развивающегося человеческого мозга, данные авторов указывают на тонкую взаимосвязь между этими факторами, при которой FEZF2 может активировать экспрессию генов модуля 20 частично благодаря способности TSHZ3 открывать области хроматина членов модуля 20 и опосредовать спецификацию глубоких слоев. Интересно, что это также включает доступность гена FEZF2, хотя влияние на экспрессию гена FEZF2 остается ограниченным и предполагает, что этой доступности противодействуют другие факторы, которые приводят к подавлению FEZF2 на более поздних стадиях развития. Хотя транскрипционные мишени TSHZ3 описаны недостаточно хорошо, сообщалось, что TSHZ3 взаимодействует с ремоделаторами хроматина и действует как репрессор транскрипции в мышечных стволовых клетках и в кортикальных нейронах взрослых крыс. Это говорит о том, что анализ с использованием мета-атласа, подобный стратегии, используемой здесь, может связать такие гены, как FEZF2 и TSHZ3, которые не были тесно функционально связаны с развитием человека, выявляя тонкие взаимосвязи с потенциальными последствиями для уязвимости к нарушениям развития нервной системы.

Эти данные, а также результаты иммуноокрашивания, подтверждающие пространственно-временную совместную экспрессию других элементов метамодуля, дают авторам уверенность в достоверности и биологическом понимании, предлагаемых набором метамодулей. Таким образом, конвейер из метамодулей предоставляет ортогональный метод, который может быть объединен с другими существующими алгоритмами совместной экспрессии генов для оптимального изучения новой биологии. Эти метамодули не только обеспечивают метод увязки того, как подтипы коры головного мозга взрослого человека могут инициироваться и формироваться в развивающейся коре головного мозга человека, но и обеспечивают основу для дальнейшего функционального изучения этих метамодулей, что позволит получить механистическую информацию.

Таким образом, описанный здесь мета-атлас является полезным ресурсом для данной области, и, чтобы обеспечить широкий доступ и взаимодействие, авторы создали клеточные браузеры, которые объединяют как базовую экспрессию генов, так и активность метамодулей в интерфейсе с возможностью поиска. Более того, их стратегия создания мета-атласов универсальна — она позволяет создавать более крупные мета-атласы, которые могут включать в себя будущие наборы данных от консорциумов, или создавать мета-атласы для множества других сложных биологических систем.

Больше подробностей в оригинальной статье на английском: https://www.nature.com/articles/s41593-025-01933-2