Понимание патофизиологии колонизации Pseudomonas aeruginosa как руководство для будущего лечения хронических ран

Хронические язвы и пролежни представляют собой серьезную проблему здравоохранения, затрагивающую 1–2 % населения во всем мире. При хронических язвах воспалительный процесс приводит к дисбалансу между патологическими факторами и иммунной защитой, способствуя колонизации как грамположительных и грамотрицательных бактерий; при этом Staphylococcus aureus и P. aeruginosa являются наиболее распространенными изолированными возбудителями.

Хроническая бактериальная колонизация ран приводит к образованию биопленок, которые представляют собой полимикробные популяции, включенные во внеклеточные полимерные материалы.

Биопленки могут затягивать цикл воспаления в хронической ране, что, в свою очередь, задерживает заживление. Раны, колонизированные P. aeruginosa, характеризуются большей площадью поверхности и, как правило, заживают хуже по сравнению с ранами без его присутствия. Ситуация усугубляется растущей приобретенной резистентностью P. aeruginosa к широкому спектру антибиотиков.

Патофизиология хронических ран и роль роста бактерий

Хронические язвы колонизируют многочисленные виды бактерий, причем 50% ран обычно содержат от четырех до шести различных видов. К этим видам относятся S. aureus (93,5% язв), Enterococcus faecalis (71,7%), P. Aeruginosa (52,2%), виды Proteus (41,3%) и анаэробные бактерии (39,1%). После заселения многие из них остаются в ране длительное время.

P. aeruginosa — грамотрицательный условно-патогенный микроорганизм, который в большом количестве присутствует в хронических ранах. Язвы, размер которых превышает 10 см2 и/или которые существуют длительное время, чаще всего дают положительный результат при культивировании на P. aeruginosa.
В целом, язвы, колонизированные P. aeruginosa, имеют площадь поверхности, которая в 3-4 раза превышает площадь поверхности язв, не колонизированных этим микроорганизмом.

Факторы вирулентности P. aeruginosa в хронических ранах

P. aeruginosa обладает способностью вызывать прямое повреждение эпителия, а также нарушать механизмы восстановления эпителия после повреждения. Это возможно благодаря ряду факторов вирулентности, которые продуцирует бактерия, включая жгутик для подвижности, адгезины для первоначального прикрепления к клеткам и секрецию различных факторов, которые вызывают повреждение клеток и позволяют бактериям сохраняться. Многие из этих факторов вирулентности регулируются процессом, известным как кворум-сенсинг (QS), который представляет собой межклеточный сигнальный путь, позволяющий бактериальной колонии синхронизировать свое поведение таким образом, чтобы это способствовало их выживанию. QS имеет жизненно важное значение для образования и созревания биопленки, что, в свою очередь, также способствует хроническому течению заболевания и устойчивости к антибиотикам. Все эти факторы в сочетании со способностью бактерий вызывать воспалительную реакцию замедляют заживление ран.

P. aeruginosa имеет один полярный жгутик, который не только обеспечивает ей подвижность, но также имеет решающее значение для инвазии и сохранения бактерий при подкожной инфекции. Кроме того, более короткие реснички позволяют бактериям прикрепляться к клеткам хозяина и обеспечивают им подвижность.

В длительных ранах продолжающееся воспаление влияет на перфузию, снижает выработку коллагена и вызывает дегенерацию базальной мембраны, что влияет на заживление ран. Выработка экзотоксинов и цитотоксических веществ P. aeruginosa усиливает этот процесс, а протеолитическая способность этой бактерии означает, что она способна разлагать внеклеточный матрикс клеток хозяина, способствуя тем самым хронизации раны. Секреторные системы бактерии производят различные экзотоксины, которые способны нарушать целостность эпителия и снижать эффективность его восстановления.

Образование биопленки P. aeruginosa в хронических ранах

Биопленка представляет собой структурированный конгломерат бактерий и внеклеточного матрикса, содержащего полисахариды, белки и внеклеточную ДНК. Образование биопленки задерживает заживление, защищает бактерии от защитных механизмов организма-хозяина и повышает устойчивость бактерий к антимикробным препаратам.

Рост и рассеивание биопленки стимулируются QS, который используется бактериями для взаимодействия друг с другом посредством сигнальных молекул. QS использует малые молекулы (аутоиндукторы) и позволяет им контролировать плотность местной популяции, наращивая её.

Факторы, которые могут бороться с инфекцией P. aeruginosa, такие как комплемент и антимикробные пептиды, подвержены иммунному уклонению во время развития биопленки. Щелочная протеаза и эластаза, продуцируемые P. aeruginosa во время роста биопленки, инактивируют комплемент. Кроме того, альгинатный компонент P.aeruginosa, предотвращает альтернативную активацию комплемента, защищая клетки от фагоцитоза.

Иммунная дисрегуляция, вызываемая P. aeruginosa в хронических ранах

P.aeruginosa обладает способностью вызывать дисрегуляцию иммунной системы, вызывая воспалительную реакцию в труднозаживающих ранах.
P.aeruginosa умеет не только помогает образовывать биопленки, но и ингибирует фагоцитоз макрофагами и нейтрофилами. Они накапливаются на поверхности биопленки и остаются в состоянии выделения токсичных соединений и повреждения окружающих тканей хозяина. Примечательно, что длительное присутствие нейтрофилов на протяжении всего течения хронической инфекции и побочный ущерб, наносимый этими клетками, вероятно, являются еще одним фактором, приводящим к серьезным последствиям заболевания.

Факторы риска колонизации и инфицирования P. Aeruginosa

Существуют различные хорошо известные факторы риска колонизации и инфицирования P.aeruginosa, многие из которых имеют отношение к раневым инфекциям.

К местным факторам, которые могут увеличить риск инфекции P. aeruginosa, относится доступность питательных веществ. Хронические раны обнажают подкожную клетчатку и питательные вещества, создавая благоприятную среду для роста бактерий. Исследования in vivo показали, что длинноцепочечные жирные кислоты в богатых питательными веществами средах ран являются основным источником углерода, используемого бактериями, и, таким образом, имеют решающее значение для успешного развития инфекций P. aeruginosa в ранах.

Факторы риска, связанные с пациентом, могут предрасполагать его к инфекции или колонизации P. aeruginosa. Пожилой возраст и иммуносупрессия, диабет, тяжелые клинические состояния, лечение в прошлом несколькими антибиотиками могут увеличивать риск, поскольку сопутствующие инфекции и воспаления еще больше предрасполагают пациента к инфекции P.aeruginosa. Пациенты, госпитализированные в больницу, могут подвергаться воздействию нозокомиальных штаммов P. aeruginosa, причем предыдущие хирургические операции связаны с более высоким риском инфекции P. aeruginosa.

Текущие консервативные меры при хронических ранах

Лечение хронических ран является довольно сложным и требует участия многопрофильной команды, которая может адаптировать лечение к каждому отдельному пациенту.

Помимо лечения потенциальной основной причины раны (т. е. глубоких ожогов, венозной недостаточности, периферической сосудистой болезни и диабета), важным элементом подготовки раневого ложа является уменьшение биопленки. Очистка раны способствует разрушению биопленки, позволяя ране перейти из воспалительного состояния в состояние заживления. После механической очистки раны можно промыть ее обычным физиологическим раствором, а затем провести дезинфекцию с помощью местных антисептиков для колонизированных ран, они могут помочь уменьшить бактериальную нагрузку и обычно хорошо переносятся. Считается, что серебро прикрепляется к бактериальной клеточной мембране и связывается с ключевыми строительными блоками в клетке, поэтому продукты, содержащие серебро (т. е. «серебряные повязки») рекомендуются для ран, которые клинически инфицированы или считаются подверженными риску инфицирования P. aeruginosa.

Варианты антимикробного лечения инфекций, вызванных P. aeruginosa, как правило, неэффективны ввиду растущей распространенности многолекарственно-устойчивых (MDR), широколекарственно-устойчивых (XDR) и панлекарственно-устойчивых (PDR) штаммов Pseudomonas. Исследования показали, что от 10% до 59% всех бактерий, выделенных из хронических ран, являются штаммами MDR. Учитывая то, что биопленки P.aeruginosa делают бактерии высокоустойчивыми к антибиотикотерапии, неудивительно, что изоляты P.aeruginosa из ожоговых и хирургических ран чаще всего являются штаммами MDR. Это ограничивает терапевтические возможности для растущего числа пациентов, подверженных риску инфекции.
Несмотря на адекватную медикаментозную терапию, хронические раны имеют тенденцию рецидивировать в 50–70% случаев.

Будущие терапевтические мишени

В связи с появлением MDR P.aeruginosa большинство антибиотиков широкого спектра действия, которые используются для лечения этих инфекций, в настоящее время считаются неэффективными, а создание новых антибиотиков ограничено недостатком доступных мишеней.
Учитывая, что антибиотикорезистентность сама по себе не объясняет вирулентность бактерий, при разработке новых терапевтических методов лечения, возможно, необходимо учитывать такие характеристики микроорганизма, как система QS и система секреции токсинов.
Новые методы лечения, такие как агенты, рассеивающие биопленку, антимикробные пептиды, фаговая терапия, вакцинация и иммунотерапия, также изучаются в качестве вариантов лечения инфекций, вызванных P. aeruginosa.

Разрушение биопленки

Ввиду очевидной важности образования биопленки для устойчивости P.aeruginosa в хронических ранах, стратегии, нарушающие или обращающие вспять этот процесс, могут способствовать заживлению ран и снижению риска инфекции. QS считается целью для разработки противоинфекционных стратегий, особенно в отношении антибиотикорезистентных организмов, таких как P. aeruginosa.
Разрушение биопленок путем ингибирования системы QS является потенциальным вариантом борьбы с микробной инфекцией, и попытки сделать это показали ослабление вирулентности P.aeruginosa и образования биопленок при клинических инфекциях.

P. aeruginosa имеет три основные регуляторные системы QS, для каждой из которых были синтезированы специфические молекулы, которые блокируют связывание аутоиндукторов QS с их соответствующими рецепторами. Таким образом возможно снизить транскрипцию генов, связанных с QS, и ослаблять вирулентность P. aeruginosa.
Известно, что имбирь содержит различные мощные противовоспалительные соединения, в том числе зингерон, который обладает способностью модулировать архитектуру биопленки P. aeruginosa. Использование зингерона in vitro снижает подвижность бактерий и значительно влияет на способность образования биопленки за счет прямой блокады белков-рецепторов QS. Подтверждение использования зингерона в качестве препарата, способного подавлять образование биопленки P.aeruginosa в хронических ранах, безусловно, является одним из вариантов.
Другой природный антагонист был выделен из австралийских красных водорослей (Delisea pulchra). Это соединение известно как ингибитор QS, и Hentzer et al. использовали его для разработки нового вещества, которое они назвали «фуранон C-30». В присутствии C-30 биопленки P. Aeruginosa эффективно растворялись и становились более чувствительными к лечению тобрамицином.
Химическое ослабление вирулентности бактерий является привлекательной концепцией потому, что такие агенты с меньшей вероятностью оказывают селективное давление на развитие резистентных мутантов.

Антимикробные пептиды

Антимикробные пептиды (АМП) исследуются в качестве терапевтических средств для лечения инфекционных заболеваний, в том числе вызванных P.aeruginosa. Это группа естественных пептидов врожденного иммунного ответа, которые активны против патогенов, таких как бактерии, вирусы и грибки, и производятся в больших количествах в областях инфекции или воспаления. Некоторые из преимуществ АМП заключаются в том, что они быстро убивают бактерии и не склонны к развитию резистентности.

У человека две основные категории АМП — это дефензины и кателицидины. Они широко представлены в эпителии человека, в том числе в коже, и вырабатываются в ответ на антимикробные стимулы.
Дефензины в большом количестве вырабатываются у человека кератиноцитами, а вот человеческий кателицидин существует всего один – он может быть найден в эпителии кожи и действует как антимикробное средство широкого спектра действия, способствует заживлению ран, регулируя миграцию клеток, воспаление и ангиогенез. При хронических ранах снижение его продукции может приводить к активному и стойкому воспалительному процессу.

Существует ряд АМП, которые одобрены для клинического использования в качестве альтернативы антибиотикам, в том числе низин, грамицидин, полимиксины, даптомицин и мелиттин. Из них полимиксины (B и E) проявляют активность против многолекарственно-устойчивых грамотрицательных бактерий, таких как P.aeruginosa, и считаются средством последней линии для использования при серьезных системных инфекциях.

На практике для обеспечения эффективной антимикробной активности АМП требуются высокие концентрации и их повторное введение, что приводит к потере селективности, связыванию и разрушению мембран клеток. Неконтролируемая доставка АМП связана с местной и системной цитотоксичностью, поэтому в настоящее время изучаются такие методы, как системы контролируемого высвобождения АМП. Для достижения этой цели АМП должны быть инкапсулированы в наночастицы из биоматериалов, таких как полимерные носители (например, наночастицы хитозана), неорганические материалы (например, наночастицы золота) и компоненты на основе липидов (например, твердые липидные наночастицы, наполненные полимиксином, обладают повышенными окклюзионными свойствами, что позволяет продлить увлажнение кожи, а также эффективны против резистентных штаммов P. aeruginosa).
Гидрогелевые составы поддерживают влажную среду и используются в повязках для ран. Антимикробные гидрогели с АМП, являются потенциальным средством для лечения хронических инфицированных ран. Полимиксин E, например, был успешно интегрирован в гидрогели для лечения инфекций ожоговых ран.

Подавление факторов вирулентности

Вместо бактерицидных методов, инфекцию P. aeruginosa можно также подавить, воздействуя на сами факторы вирулентности. Основными мишенями являются система секреции III типа (T3SS) и главные регуляторы вирулентности. T3SS вводит токсичные эффекторы в клетки хозяина, вызывая острую инфекцию, поэтому вмешательство в эту систему может потенциально блокировать острые инфекции, вызываемые P.aeruginosa. На сегодняшний день разработано более 10 классов подобных ингибиторов.

Одной из возможных стратегий нарушения работы T3SS является блокирование ее главных регуляторов. В сети вирулентности P. aeruginosa насчитывается более 30 регуляторов, участвующих в контроле QS, T3SS и T6SS. Ингибирование экспрессии регуляторов QS в моделях доказало снижение вирулентности P. aeruginosa, хотя их высокая концентрация, несмотря на эффективное уничтожение бактерий, может быть цитотоксичной для клеток.

Вакцины и моноклональные антитела против P. aeruginosa

Профилактическая вакцинация и терапевтические моноклональные антитела (MAbs) становятся привлекательным вариантом для ограничения и/или лечения инфекции, вызванной антибиотикорезистентным P.aeruginosa. Вакцины против P. aeruginosa разрабатываются уже много лет, однако пока еще не найдена вакцина, пригодная для применения у людей. Трехвалентная вакцина, протестированная на мышиных моделях, продемонстрировала повышенную выживаемость при инфекциях ожоговых ран, вызванных P. aeruginosa. Другая вакцина была протестирована на мышиной модели сепсиса ожоговых ран, продемонстрировав способность ингибировать системное распространение инфекции P. aeruginosa.

Пассивная иммунотерапия против P.aeruginosa с помощью MAbs представляет собой альтернативу или дополнение к антибиотикотерапии и продемонстрировала излечение инфекций, сокращение срока пребывания в больнице и снижение заболеваемости и смертности.
MAbs обычно получают из мышей, однако была разработана техника использования человеческих В-лимфоцитов для производства терапевтических MAbs. Были созданы антитела, направленные на нейтрализацию факторов вирулентности P.aeruginosa.
MAbs, нацеленные на липополисахариды бактерий, также были разработаны в форме IgM-антител. Панобакумаб был разработан как IgM/k-изотип, направленный против P.aeruginosa и был успешно использован для лечения пациентов в отделениях интенсивной терапии с вентиляторной пневмонией. Клинические испытания иммуноглобулинов также были проведены, и использование раствора для полоскания горла Ig-Y против P.aeruginosa у пациентов с муковисцидозом привело к более позднему времени инфицирования P.aeruginosa и более позднему началу хронической инфекции.

Восстановление реакции иммунной системы

Раневой экссудат имеет важное значение для заживления и состоит из множества факторов, способных противостоять инфекции, в том числе высокого уровня белков комплемента. Система комплемента человека это ряд различных белков плазмы крови, которые могут помечать патогенные микроорганизмы и инициировать реакции для борьбы с инфекцией. Однако в некоторых случаях специфические антитела дают противоположный эффект, защищая бактерии от уничтожения комплементом. Это нарушение уничтожения комплементом, опосредованное антителами, наблюдалось у пациентов, инфицированных грам-отрицательными бактериями, такими как Escherichia coli, Salmonella enterica и P. aeruginosa.

Устойчивость P.aeruginosa к комплементу (serum killing) считается важной характеристикой вирулентности, и плазмоустойчивые P. aeruginosa часто выделяются из ран. Несмотря на это, почти 50% изолятов из ран по-прежнему остаются чувствительными к плазме здоровых контрольных лиц. Как эти изоляты выживают в богатой комплементом среде раны, в настоящее время неизвестно.
Наличие и влияние маскирующих антител (cAbs) было широко изучено в контексте хронического заболевания легких, вызванного P.aeruginosa. Маскирующие антитела присутствуют у 20% взрослых пациентов с бронхоэктазией, не связанной с муковисцидозом, у 32% пациентов с муковисцидозом и до 40% пациентов после трансплантации легких. Важно отметить, что наличие cAbs также связано с худшими исходами у этих пациентов, включая ухудшение функции легких и более высокую частоту хронической дисфункции легких после трансплантации и смертности. Эти антитела также распространены при острых инфекциях: у 24% пациентов с E. coli и 33% пациентов с P. aeruginosa.

Удаление «маскирующих антител» было использовано в качестве нового метода лечения инфекций, вызванных мультирезистентными штаммами P. aeruginosa. У нескольких пациентов с хроническими респираторными инфекциями, вызванными P. aeruginosa, плазмаферез был использован для удаления всех антител из организма пациента, с заменой донорскими.
После лечения эти пациенты стали отрицательными по P. aeruginosa, что представляет собой новую стратегию лечения MDR-бактерий. Поскольку эти антитела необходимо удалять только локально в ране, это может быть привлекательным вариантом лечения инфекций P. aeruginosa хронических ран.

Фаговая терапия

Бактериофаги — это вирусы, которые размножаются внутри бактерий и могут быть либо литическими (разрушающими бактерии после завершения размножения), либо лизогенными (интегрирующимися в геном, наследуемыми дочерними клетками и становящимися литическими под воздействием стрессовых факторов окружающей среды). Первые из них более полезны в терапевтических целях.
Во многих недавних исследованиях изучалась фаговая терапия хронических ран в условиях in vitro, in vivo и в клинических условиях. In vitro было показано, что фаги эффективны против 74–92,7% P. aeruginosa, выделенных из диабетических язв стопы. Это свидетельствует о потенциале усовершенствования эффективности бактериофагов путем оптимизации и развития.

Другие исследования in vitro показали синергетический эффект фаговой терапии с антибиотиками.
В ограниченном числе клинических испытаний фаги использовались для борьбы с P.aeruginosa в хронических ранах. Два исследования одной и той же исследовательской группы были проведены на пациентах с хроническими ранами, сохраняющимися более 6 недель. В первоначальном исследовании 9 из 20 пациентов с P. aeruginosa получали лечение с помощью коктейля из трех фагов (для P. aeruginosa, S. aureus и E. coli) в виде жидкости, наносимой на рану. Все участники достигли стерильности ран к 13-му дню. В следующем исследовании использовалась персонализированная фаговая терапия с применением монофага или фагового коктейля в зависимости от инфекции. В этой когорте раны, содержащие P. aeruginosa, имели наибольшее уменьшение площади за 90 дней по сравнению с ранами с E. coli и Klebsiella pneumoniae. Это демонстрирует, что персонализированная фаговая терапия может иметь повышенную эффективность. В настоящее время проводится много других клинических испытаний фаговой терапии, однако единственные, направленные на P. aeruginosa, касаются ожоговых ран и пролежней.
Для любого нового метода лечения важнейшее значение имеют безопасность и приемлемость для пациентов. В систематическом обзоре была оценена безопасность различных испытаний фагов и установлено, что для трудноизлечимых ран не было зарегистрировано никаких побочных эффектов при местном лечении и только один легкий побочный эффект при внутривенном введении. Была проведена фокус-группа для пациентов с диабетическими язвами стопы по поводу фаговой терапии, и по результатам - более 85% пациентов согласились бы принять фаговую терапию, если бы их врач рекомендовал.