Пол экспериментатора влияет на результаты экспериментов на животных

Хотя эта идея совсем не очевидна для большинства, много исследований в течение нескольких десятилетий показывают, что результаты поведенческих экспериментов на мышах и крысах могут различаться, если их проводят мужчины и женщины. К примеру, об этом факте нам говорили на курсах по работе с экспериментальными животными - если эксперименты делают несколько человек, то стоит следить, чтобы они менялись равномерно, а не тестировали сравниваемые группы животных. И вот, новая работа в ведущем нейробиологическом журнале Nature Neuroscience проливает свет на физиологические механизмы этого явления.

Экспериментаторы не принимали утром душ и не использовали парфюм, косметику и дезодоранты. Мыши не контактировали ни с какими людьми за 2 дня до экспериментов, также эксперименты проводились спустя как минимум 3 дня после смены клетки (раз в две недели мыши перемещаются в чистую клетку со свежей постилкой из опилок).

Предпочтение запаха мужчин или женщин оценивали в 3-лучевом Y-образном лабиринте. У исследователей брали мазок с кожи на сгибе локтя, на запястье и за ухом. В один рукав лабиринта клали вату с мужским запахом, в другой с женским. Мыши обоих полов и трех разных линий достоверно чаще заходили в рукав с женским запахом (Рис. 1а). Более того, выбирая между ватой с водой и ватой с запахом человека, мыши предпочитали женский запах, но избегали мужского (Рис. 1с). Аналогичная картина наблюдалась при предъявлении мужских и женских футболок (Рис. 1d).

Рис. 1. Предпочтение ваты с женским запахом вате с мужским (a) исчезает после блокады обоняния (b). Предпочтение женского запах и избегание мужского запаха при предъявлении ваты с мазками (c) и футболок (d)

Далее исследователи напрямую сравнили эффект мужского и женского запаха. Если в трех рукавах Y-лабиринта расположить вату с водой, муским и женским запахом, то в рукаве с мужским запахом мыши проводят достоверно меньше времени, но в рукаве с женским - столько же сколько в контрольном (Рис. 1е-f). Аналогичный результат получился в тесте предпочтения места с двумя большими камерами (без запаха и с запахом) и маленькой стартовой камерой (Рис. 1 g-h). Таким образом, мужской запах действительно является для мышей негативным (аверсивным) стимулом, а вот женский похоже нейтрален.

Рис. 1. Избегание мужского запаха, отсутствие предпочтения женского запаха в Y-лабиринте (e-f) и тесте предпочтения места в трехотсечной камере (g-h)

Следующим вопросом было, меняется ли эта картина под действием стресса. Для это мышей помещали в воду комнатной температуры без возможности самостоятельно выбраться. Парадигма вынужденного плавания используется как модель стресса с одной стороны, и как тест на депрессивноподобное поведение для тестирования антидепрессантов с другой (об этом я подробно рассказывал в статье на Биомолекуле). В экспериментах, проводимых мужчинами, мыши демонстировали более выраженное депрессивноподобное поведение, чем в экспериментах, проводумых женщинами - позже начинали чиститься, если распылить на них сладкую воду (Рис. 1j). Так же у них был выше уровень тревожности - они позже подходили к пище в незнакомой обстановке (Рис. 1k). Врочем, стоит отметить, что в этом и последующих экспериментах использовались только мыши-самцы.

В другой модели стресса, где самец содержится вместе в более крупным и агрессивным сородичем, подвергаясь агрессии и нападкам, мыши, с которыми работали мужчины, были более чувствительны к стрессу (Рис. 1 l,m) .

Рис. 1. Время начала груминга после распыления сладкой воды (j), время начала еды в незнакомой обстановке (k). Успешное избегание места получения удара током (l), доля чувствительных к социальному стрессу мышей (m).

Так как подобные модели на мышах часто используются для тестирования фармакологических преператов, исследователи решили сравнить антидепрессивный эффект кетамина - быстродйствующего антидепрессанта, разрешенного к использованию в США под маркой Spravato (если быть точным, это эскетамин - зеркальный изомер кетамина). Антидепрессивный эффект в тесте вынужденного плавания как у самцов (Рис. 2A), так и у самок (Рис. 2B) наблюдался только в экспериментах, проводимых мужчинами.

Рис. 2. Антидепрессивный эффект кетамина у самцов (А) и самок (В) проявляется только в экспериментах, проводимых мужчинами

В модели социального стресса кетамин также восстанавливал потребление сахарозы у мышей только в экспериментах, проводимых мужчинами (Рис. 3).

Рис. 3. Влияние кетамина на потребление сахарозы (симптом депрессивноподобного поведения) после социального стресса в экспериментах, проводимых мужчинами и женщинами.

Известный побочный эффект кетамина (отсутствующий у разрешенного антидепрессанта эскетамина) - гипервозбуждение, доходящее до психоза. Он используется для моделирования симптомов шизофрении на мышах, так как приводит к повышенной двигательной активности. Однако этот эффект не зависел от пола экспериментатора (Рис. 4), что по-видимому указывает на разные нейрофизиологические механизмы двух эффектов кетамина. Аналогично не зависит от пола экспериментатора эффект трициклического антидепрессанта дезипрамина. Классические антидепрессанты действуют через систему моноаминов (серотонин, норадреналин, дофамин), в то время как кетамин и эскетамин - через систему глутамата.

Рис. 4. Эффект кетамина на двигательную активность мышей в экспериментах, проводимых мужчинами и женщинами

Далее исследователи пытаются понять, почему от пола экспериментатора зависит эффект одних антидепрессантов, но не других, для чего подробно рассматривают работу системы гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Это ключевая для стресса и тревожно-депрессивных расстройств гормональная система из трех звеньев: гипоталамус выделяет кортиколиберин (CRH), он стимулирует выработку гипофизом адренокортикотропного гормона (АКТГ), а он заставляет кору надпочечников выбрасывать в кровь кортизол для борьбы со стрессом (в первую очередь, путем питания нейронов глюкозой). Но кроме гормональных функций кортиколиберин играет роль важного нейромедиатора в структурах мозга, участвующих в эмоциях (прежде всего страха и агрессии) и реакции на стресс. В предыдущих работах [1] было показано, что мужской запах активирует эту стресс-систему у грызунов.

Как сказано выше, введение кетамина женщинами не приводило к антидепрессивному эффекту у мышей. А вот предварительная внутримозговая инъекция кортиколиберина обеспечивала эффективность кетамина в тесте вынужденного плавания (Рис. 5а) и тесте активного избегания (Рис. 5b). При этом блокада рецепторов кортиколиберина предупреждала антидепрессивный эффект кетамина у экспериментаторов-мужчин в тесте предпочтения сахарозы (Рис. 5d) и тесте вынужденного плавания (Рис. 5е).

Рис. 5. Роль кортиколиберина в антидепрессивном эффекте кетамина при введении женщинами (a, b) и мужчинами (d, e)

Более того, избегание мужского запаха в Y-лабиринте, о котором говорится в начале статьи (Рис. 1-2), так же исчезало при блокаде рецепторов кортиколиберина (Рис. 6). Различия в изменениях ЭЭГ при введении кетамина мужчинами и женщинами также исчезают при блокаде рецепторов кортиколиберина.

Рис. 6. Избегание мужского запаха в Y-лабиринте при блокаде рецепторов кортиколиберина

Как было сказано, кетамин действует на глутаматную систему мозга. Глутамат - основной нейромедиатор в центральной нервной системе с несколькими типами рецепторов. Хотя долгое время основной мишенью кетамина считались NMDA рецепторы, с ними вероятно связан психотический эффект, а антидепрессивный, по доминирующей сейчас гипотезе опосредуется АМРА рецепторами [2, 3]. Так вот, количество этих рецепторов в гиппокампе (струкрутура мозга, предположительно ключевая для антидепрессивного эффекта кетамина) усиливалось только, когда кетамин вводили экспериментаторы-мужчины (Рис. 7).

Рис. 7. Усиление количества АМРА-рецепторов в гиппокампе при введении кетамина мужчинами и жещинами

Далее методами иммуногистохимического окрашивания и электрофизиологической регистрации активности определенных типов нейронов авторы подтвердили, что важные для депрессии участки гиппокампа действительно регулируются с участием кортиколиберина. Кортиколибериновые нейроны сидят в энторинальной коре и посылают свои отростки в гиппокамп для его регуляции. И наконец, завершающей частью масштабного исследования стали оптогенетические эксперименты. Методами генной инженерии можно создать мышей, у которых тонким световодом можно активировать или подавлять определенные типы нейронов и анализировать при этом их поведение.

Как было показано ранее, введение кетамина экспериментаторами-женщинами не приводило к антидепрессивному эффекту у мышей (Рис. 2-3). А вот оптогенетическая активация кортиколибериновых нейронов в энторинальной коре обеспечивала такой эффект, вероятно воспроизводя присутствие мужского запаха (Рис. 8).

Рис. 8. Оптогенетическая активация кортиколибериновых нейронов энторинальной коры обеспечивает антидепрессивный эффект кетамина при введении женщинами

Кроме того, исследователи обнаружили усиление количества активных кортиколибериновых нейронов в ответ на предъявление мужского запаха. Аналогичная оптогенетическая активация воспроизводила избегание мужского запаха (точнее, соответствующего отсека камеры). Напротив, торможение нервных проекциий из энторинальной коры с гиппокамп с помощью методов хемогенетики (генетическое конструирование и вставка искусственных рецепторов, на которые действуют только искусственные молекулы) подавляло избегание мужского запаха. Третий метод - кальциевый имаджинг, позволяет в режиме реального времени оценивать активность определенных нейронов. Он так же подтвердил, что в Y-лабиринте с контрольным, мужским и женским запахами кортиколибериновые нейроны энторинальной коры активируются при заходе в рукав с мужским запахом.

Данные исследования не только подтверждают, что мужской запах является стрессом для мышей, но и показывают что антидепрессивный эффект кетамина, (но не трициклических антидепрессантов) засисит от пола экспериментатора. Сложными нейрофизиологическими методами авторы убедительно показывают роль кортиколиберина в этом эффекте - воздействуя на кортиколибериновые нейроны можно воспроизвести эффект мужского присутствия в экспериментах, проводимых женщинами.

Все больший объем данных свидетельствует о том, что пол исследователей может радикально менять результаты экспериментов. В связи с этим многие ученые предлагают явно указывать в методическом разделе научных статей пол экспериментатора. И это предложение выглядит все менее и менее радикальным.