Гипоосмотический тест

Тест на гипоосмотическое набухание также проводится для дифференциации живых и мертвых сперматозоидов.

Раствор для теста. Растворить 0,735 г цитрата натрия дигидрата и 1,351 г фруктозы в 100 мл дистиллированной воды, разлить в пробирки Эппендорфа по 1 мл и хранить при t -20 °С. Перед употреблением размораживать и тщательно перемешивать.

Ход исследования. Согреть 1 мл раствора в пробирке Эппендорфа в течение 5 мин при 37 °С. Добавить 0,1 мл разжиженного эякулята и перемешать пипеткой. Инкубировать смесь при 37 °С не менее 30 мин, но не более 120 мин и исследовать сперматозоиды в фазово-контрастном микроскопе. Набухание сперматозоидов идентифицируют по изменению формы их хвостов. Считают число набухших клеток на 200 исследуемых сперматозоидов, и выводят процент набухших сперматозоидов.

Оценка теста. Результаты считаются нормальными, если произошло набухание хвоста более чем у 60% сперматозоидов. Если набухание хвоста произошло менее чем у 50% сперматозоидов, то данный образец расценивается как патологический, в котором больше половины мертвых сперматозоидов.

Примечание. Перед проведением теста на гипоосмотическое набухание необходимо подсчитать в нативном препарате количество сперматозоидов с закрученными хвостами (если они есть в эякуляте). Число сперматозоидов с закрученными хвостами вычитают из числа сперматозоидов с набухшими хвостами для получения истинного количества мертвых сперматозоидов. Динамическое исследование эякулята не вошло в стандартные протоколы исследования ВОЗ, но продолжает производиться в некоторых КДЛ.

Исследования проводятся через 3, 6 и 24 часа после получения эякулята по стандартным методикам, определяющим следующие параметры. Через 3 и 6 часов:

• Вязкость эякулята.

• Агглютинация сперматозоидов.

• Подвижность сперматозоидов.

• Жизнеспособность сперматозоидов. Через 24 часа:

• Вязкость эякулята.

• Агглютинация сперматозоидов.

• Подвижность сперматозоидов.

• Жизнеспособность сперматозоидов.

Лейкоциты в эякуляте

К круглым клеткам эякулята относят эпителиальные клетки, лейкоциты, макрофаги, незрелые половые клетки. Их количество не должно превышать 5 х 106/мл спермы. В норме в эякуляте содержится менее 1 х 106/ мл лейкоцитов, это преимущественно нейтрофилы. Повышенное количество лейкоцитов носит название лейкоспермии. В нативном препарате эякулята нейтрофилы - это круглые, сероватые, мелкозернистые клетки диаметром 14-16 мкм. В щелочной среде спермоплазмы (рН обычно 7,5-8,0) нейтрофилы выглядят несколько крупнее, чем в крови. Если рН спермы на верхней границе нормы или превышает ее, клетки разбухают еще больше, просматривается броуновское движение нейтрофильных гранул и видны сегментированные ядра. Это особенно четко видно, если на покровное стекло нанести каплю иммерсионного масла и перевести микроскоп на иммерсионный объектив (х90 или х100). Лейкоциты считают в 100 больших квадратах камеры Горяева. Расчет проводят по формуле: L=(a*250*10*1000)/100 где L - количество лейкоцитов в 1 мл эякулята, а - количество лейкоцитов в 100 больших квадратах, 250 - 1/250-объем одного большого квадрата, 10 - степень разведения спермы, 1000 - 1000 мкл в 1 мл эякулята, 100 - количество больших квадратов. Окончательный вариант формулы: L = а х 25 000.

Если количество лейкоцитов большое, можно считать клетки в 40 больших квадратах (20 квадратов вверху сетки и 20 - внизу). Расчет вести по формуле: L=a*250*10*1000/40. где а - количество лейкоцитов в 40 больших квадратах, 250 - 1/250-объем одного большого квадрата, 10-степень разведения спермы, 1000 — 1000 мкл в 1 мл спермы, 40 - количество больших квадратов. Окончательный вариант формулы: L = а х 62 500. В руководстве ВОЗ предлагается диагностировать нейтрофилы в сперме цитохимическими методами:

Метод окрашивания препарата на миелопероксидазу с использованием ортотолуидина.
2. Иммуноцитохимический метод, который позволяет дифференцировать в препарате спермы макрофаги, нейтрофилы. В- и Т-лимфоциты. Обнаружение лейко- или пиоспермии является сигналом для проведения микробиологического исследования эякулята.

Источник: https://medicalplanet.su/diagnostica/441.html MedicalPlanet