Как определяют клональность?
Моноклональную лимфопролиферацию необходимо отличать от поликлональной реактивной пролиферации лимфоцитов. Чтобы сделать это, нам понадобится молекула, которая есть в каждой В-клетке, но в то же время для каждой из них является уникальной. Идеальный претендент — ДНК, а именно та последовательность, которая сформировалась в результате V(D)J рекомбинации. Десятки человек с одним и тем же паспортом должны вызвать подозрения. Так же и с клетками.
Что произойдет с кровью пациента, которую отправляют на исследование?
- Первый этап — из лейкоцитов, которые находятся в периферической крови, нужно выделить ДНК. Для этого их мембрану необходимо разрушить, из всего содержимого, которое "освободилось" из клетки, необходимо отобрать ДНК, а белки, жиры и другие молекулы нужно удалить. Все это происходит за счет добавления разных реактивов, а последовательность действий можно описать так: добавил, перемешал, открутил, отобрал, осадил — повторил. В результате получается пробирка с ДНК.
- Второй этап — постановка ПЦР для увеличения количества того участка ДНК, который необходимо исследовать. В целом, самое главное в постановке ПЦР это правильно составленный протокол и внимательность при его выполнении. О том, как работает ПЦР, лучше не читать, а смотреть.
https://youtu.be/7beN35g5xuM?si=Rkerf9j2MOZeix3d https://youtu.be/TAnx9963SRw?si=Z976kg_abqz7cdoc
- Третий этап — оценка длины продуктов ПЦР с помощью фрагментного анализа. (Кстати, этот метод используется и для оценки статуса MSI в опухоли. На всякий случай уточню, что это я про фрагментный анализ, а не про определение клональности).
Для постановки ПЦР необходимо подобрать праймеры так, чтобы они позволяли амплифицировать участки ДНК, покрывающие все возможные перестроенные V(D)J экзоны (выбранные V(D)J-рекомбинацией) и фланкировать участки их соединения (в которых, как мы помним, происходят вставки и делеции нуклеотидов). Из-за перечисленных процессов в каждом В-лимфоците участки ДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей, отличаются друг от друга не только последовательностью нуклеотидов (буквами), но и их протяженностью (длиной слова).
Если процесс поликлональный, то в ходе реакции будут синтезироваться ПЦР-продукты разной длины (увидим распределение Гаусса). Если моноклональный — один ПЦР-продукт будет преобладать.
Подобрать нужные праймеры оказалось непросто. Избежать ложноположительных и ложноотрицательных результатов — ещё сложнее. Поставить реакцию в одной пробирке не получится.
Благодаря работе консорциума BIOMED-2 были разработаны стандартизированные протоколы ПЦР, максимально охватывающие все возможные перестройки (включая соматически мутированные перестройки IG) для всех целевых генов (гены тяжелой цепи, легких цепей, а также гены, кодирующие Т-клеточный рецептор). Было разработано 107 различных праймеров, объединенных в 14 мультиплексных ПЦР-пробирок для анализа клональности: 3 для полного гена IGH (V-J), 2 для неполного IGH (D-J), 2 для IGK ( V-J и Kde), 1 для IGL (V-J), 2 для полного TRB (V-J), 1 для неполного TRB (D-J), 2 для TRG (V-J) и 1 для всех перестроек гена TRD.
Так к каким же участкам подобраны праймеры, если последовательность VDJ всегда разная?
Праймеры подобраны к консервативным (неизмененным) участкам — framework-регионам V-сегментов (прямые праймеры) и к J-сегментам, которые относительно стабильны (обратный праймер). Вариабельный участок, образующийся в результате V(D)J рекомбинации, находится между этими праймерами. ПЦР-продукты будут иметь разную длину в зависимости от того, какие именно V-, D- и J-сегменты были выбраны и какие модификации произошли в зоне их соединения.
Провести ПЦР-реакцию недостаточно. Необходимо визуализировать молекулы, чтобы затем их оценить. Для этого используется фрагментный анализ. Он работает по принципу электрофореза: ДНК, заряженная отрицательно, направляется от минуса к плюсу, и скорость движения молекулы зависит от ее длины. В данном случае ДНК движется по капилляру, поэтому молекулы выстраиваются цепочкой друг за другом от меньшего к большему (молекула, которая меньше, пробежит быстрее, чем длинная). За счет флюоресцирующей метки, находящейся на 5'-конце праймера, прибор детектирует ДНК. И выстраивает график:
Не менее важным этапом является интерпретация результатов. Оценивать общую картину нужно, суммируя результаты, полученные в разных пробирках. Например, стратегия комбинированной оценки IGH и IGK позволяет избежать ложноотрицательных результатов.
Опыт и насмотренность также важны. Иногда сложно отличить моноклональность от олигоклональности, а опухолевую пролиферацию от противоинфекционного иммунитета. В этом случае на помощь может прийти наличие поликлонального фона и оценка клинической картины.