Секвенирование по Сэнгеру
Слово «секвенирование» сейчас очень известно. Оно употребляется и врачами, и пациентами, особенно теми, кто был на приеме у врача-генетика, и людьми, которые хотят блеснуть эрудицией, ведь секвенирование – это крутое генетическое исследование, анализ генов.
Итак, секвенирование (от лат. sequentum - последовательность) – это чтение последовательности ДНК одного гена, нескольких генов, или всего генома.
Секвенирование применяют для выявления ошибок (например, выпадения, замены, вставки) одного или нескольких нуклеотидов – структур, из которых состоит молекула ДНК. Такие ошибки в гене приводят к нарушению синтеза белка, а значит, к развитию заболевания. Их называют патогенными вариантами, или мутациями. Обнаружение мутаций важно не только для подтверждения клинического диагноза, но и для предотвращения рождения больных детей в семье.
Для прочтения последовательности одного гена используют метод секвенирования по Сэнгеру, являющийся «золотым стандартом» молекулярно-генетической диагностики. Метод был предложен в 70-х годах ХХ века английским биохимиком Фредериком Сэнгером. За этот метод в 1980 году ученый был удостоен Нобелевской премии.
Сначала Ф. Сэнгер опубликовал технику секвенирования ДНК, которую назвал «Плюс и минус». Это была трудоемкая технология, при которой синтезировались короткие фрагменты ДНК с радиоактивными метками, которые затем подвергали фракционному электрофорезу и визуализировали. Сначала ДНК бактерий секвенировали именно так.
В 1977 году Ф. Сэнгер представил модифицированный метод чтения последовательности ДНК, при котором одна из цепочек исследуемой ДНК выступает в качестве основы (матрицы) для синтеза второй, комплементарной ей цепочки. Метод получил название «Обрыва цепи» из-за присутствия в реакции модифицированных нуклеотидов, которые останавливают синтез при включении в реакцию. Вручную такое исследование проводили в 4 разных пробирках, с последующим электрофорезом и анализом распределения радиоактивных меток.
Сейчас технология секвенирования по Сэнгеру полностью автоматизирована и для ее проведения используют специальные приборы – капиллярные секвенаторы. Первые секвенаторы, как первые ЭВМ, были громоздкими и медлительными, а также опасными из-за применения радиоактивных меток. Современные капиллярные секвенаторы занимают небольшое место на лабораторном столе, теперь в них используется флуоресцентные метки с разной длиной волны, благодаря чему реакция идет уже в одной пробирке. Для разделения смеси используют капиллярный электрофорез, а результаты, представленные разноцветными пиками, соответствующими 4 разным нуклеотидам, анализируют с помощью специальной компьютерной программы. Именно с помощью капиллярных секвенаторов был реализован проект «Геном человека».
Для прочтения последовательности нескольких генов (десятков до нескольких сотен) или всего генома используется метод секвенирования нового поколения (англ. next generation sequencing, NGS) – автоматизированный метод с использованием сложных приборов – секвенаторов, которые позволяют прочитывать единовременно много участков генома, а некоторые секвенаторы могут читать одновременно несколько геномов.
Выделяют таргетное NGS секвенирование – прочитывают панели генов, мутации в которых вызывают наследственное заболевание со схожей клиникой (например, с поражением печени, судорогами или деформациями костей), клиническое экзомное и полноэкзомное секвенирование – когда исследуют все гены, которые могут привести к наследственным заболеваниям, или кодирующие части всех генов, а также полногеномное секвенирование, при котором определяют последовательность ДНК ядра и митохондрий (весь геном человека).
Какой вид NGS секвенирования использовать в каждом конкретном случае, определяет врач-генетик, который также проводит итоговое консультирование по результатам исследования.
В настоящее время, согласно Российским и международным методическим рекомендациям, все патогенные и вероятно-патогенные варианты, выявленные методом секвенирования нового поколения (NGS) необходимо подтверждать секвенированием по Сэнгеру. В медико-генетическом центре «Проген» проводится валидация вариантов, выявленных по NGS секвенированию, методом секвенирования по Сэнгеру как для отдельного пациента, так и для семьи (мать-отец-ребенок).