Амфіфільні пептиди - шлях до можливого подальшого лікування раку

Хороші моделі злоякісних пухлин потрібні як вченим, які проводять фундаментальні дослідження, так і розробникам нових протипухлинних препаратів. Зараз найчастіше для моделювання пухлин використовують традиційні двомірні культури клітин: клітини пухлини розміщують в пластикову тару, де вони ростуть, утворюючи моношар. Але при цьому, крім об'ємної структури, не відтворюються багато інших важливих властивостей пухлин і взаємодій, в які вони вступають в організмі. Об'ємні клітинні культури отримують двома способами. Можна перешкодити клітинам прикріплятися до пластику культуральної тари і створювати моношар. Цього зазвичай досягають або методом «висячої краплі», або використовуючи тару із спеціального пластика. Альтернативний спосіб - використання каркасів з різних матеріалів, до яких клітини можуть прикріпитися і створити тривимірну структуру.

Пухлина складається не тільки зі злоякісних клітин - в її склад входять клітини сполучної тканини, ендотелій та імунні клітини. Все це занурено в позаклітинний матрикс, що складається в основному із структурних білків (фібронектин, колаген, кератин) і пептидогліканів (наприклад, гіалуронової кислоти). Позаклітинний матрикс механічно підтримує клітини і забезпечує транспорт речовин між ними. Якщо присутність інших видів клітин в моделі можна забезпечити спільним культивуванням, то імітувати всі їх взаємодії in vitro практично неможливо. Вирішенням цієї проблеми є використання методів тривимірного культивування, що дозволяє відтворити структуру і реальну взаємодію між клітинами.

Ідеальна клітинна модель пухлини повинна відображати процеси взаємодії пухлини та мікрооточення. Зараз при створенні тривимірних клітинних культур дослідники найчастіше використовують Matrigel - реагент, що складається з білків позаклітинного матриксу та факторів зростання, які виділяють пухлинні клітини мишей. Щоб отримати тривимірну культуру, в розчин матригеля, який полімеризується при звичайних для культивування умовах, просто додають клітини пухлини. Вони агрегують, збираючись в невеликі грудки, і потім діляться, утворюючи сфероїди, в яких клітини взаємодіють і один з одним, і з позаклітинним матриксом, - як у справжній пухлини, тільки в мініатюрі.

Незважаючи на популярність, у матригеля є кілька мінусів. По-перше, його отримують з клітин миші, тому він відрізняється від складу позаклітинного матриксу людини. По-друге, як не дивно, ми до сих пір не знаємо його точний склад: хоча були наукові праці, присвячені його детальній характеризації, через обмеження методів не вдалося до кінця встановити, які речовини і в яких кількостях входять в матрігель. Більш того, склад матрігеля може трохи змінюватися від партії до партії.

Через це вчені продовжують шукати інші матеріали, які підходять для створення тривимірних клітинних моделей. Міжнародний колектив дослідників під керівництвом Альваро Мати вирішили використовувати інший підхід для дослідження.

Вони приготували гідрогель з двох компонентів. Перший компонент - розчин кератину або суміш розчинів кератину і фібронектину. У ньому немає нічого дивного: ці білки є у позаклітинному матриксі епітеліальних пухлин яєчника. А ось другий компонент - амфіфільних пептиди (АП) - виявився ключовим для успіху дослідження. Перебуваючи у водному розчині, ці молекули на основі пептидів можуть самостійно збиратися в схожі на структуру позаклітинного матриксу нановолокна, а також в інші форми - бульбашки, подвійні шари, міцели, стрічки, нанотрубочки. Властивості АП залежать від послідовностей амінокислот в їх молекулах, тому можна синтезувати АП з різними властивостями.

Раніше лабораторія Альваро Мати вже створювала АП з поліпшеними здібностями нановолокна, які були названі PA-H. В новому ж дослідженні ці здібності ще більше посилили, додавши послідовність амінокислот з еластину - важливого білка позаклітинного матриксу (отримані молекули АП назвали PA-VH). Додатково автори синтезували два допоміжних АП. Один з них (PA-RGDS) потенційно покращує клітинну адгезію, а другий (PA-GHK) потенційно покращує поділ клітин і може сприяти проростанню судин в пухлину.

Гідрогель складався з суміші розчинів білків і PA-VH. На мікроскопічному рівні він складається з нановолокон, зібраних з АП. Спочатку вчені перевірили, чи підходить цей гідрогель для вирощування тривимірних культур клітин. Виявилося, що підходить: він цілком витримував вагу клітин, дозволяючи їм збиратися в об'ємні структури, і був досить стабільним, щоб підтримувати її тривалий час. При цьому гідрогель не заважав клітинам секретувати позаклітинний матрикс.

Далі автори зробили висновок в гідрогель клітини епітеліальної пухлини яєчника. Клітини поміщали в розчин кератину, потім додавали розчин PA-VH. Гель з клітинами полімеризувався,. Потім його розміщували на живильному середовищі. За формуванням сфероїдів, взаємодією клітин між собою і з матриксом спостерігали протягом декількох тижнів. Одночасно такий же експеримент проводили з матригелем як матриксу - для порівняння.

Клітини в новому гідрогелі росли повільніше, ніж в матригелі, хоча це швидше властивість матригеля - прискорювати поділ клітин в культурах. Великим плюсом нового гідрогелю виявилася стабільність. Якщо в моделях на основі матригеля на третій тиждень клітини випадали зі сфероїда, а матрикс помітно руйнувався, то в моделях з нового гідрогелю цього не спостерігалося. На 21-й день експерименту збереглося 100% сфероїдов з гідрогелю, а з матригеля - тільки 60%.

Електронна мікроскопія показала, що тривимірні культури в новому гідрогелю більш компактні, поверхня має звичайну для епітеліальних клітин структуру. Крім того, було видно, що клітини прикріплені до мережі утворених гідрогелем нановолокон.

Коли пухлина стає занадто великою, її клітинам бракує кисню і вони ініціюють проростання судин. Цей процес запускають злоякісні клітини, виділяючи речовини, спрямовані клітинам ендотелію, з яких складається вистилання кровоносних судин. У культурі цей процес можна зімітувати, отримуючи сфероїди з пухлинних клітин і клітин ендотелію пупкової вени людини (HUVEC). Коли сфероїд виростає до досить великих розмірів, клітини HUVEC мігрують всередину нього - туди, де мало кисню.

У нового гідрогелю є ще одна важлива перевага перед іншими каркасами для тривимірних культур: його можна налаштовувати під різні види пухлин, додаючи необхідні компоненти, в тому числі фактори росту. Так, позаклітинний матрикс пухлин мозку відрізняється від здорових тканин мозку присутністю великої кількості гіалуронової кислоти і (або) коллагенів, а також іншим змістом протеогліканів хондроїтинсульфатів. В обговорюваному дослідженні автори використовували кератин - білок, який міститься в позаклітинному матриксі епітелію яєчника. Також можна змінювати склад і властивості амфіфільних пептидів і отримувати наноструктури матриксу, характерні для досліджуваного органу. Крім того, такі гідрогелі можна використовувати для 3Д- біодруку і створення штучних тканин і органів.