Ретромер способствует лизосомальному обновлению мтДНК

Аннотация

Митохондриальная ДНК (мтДНК) подвергается многочисленным повреждениям, вызванным нормальной клеточной функцией. При стрессе репликации мтДНК митохондриальный геном переносится в эндосомы для деградации. Используя биотинилирование от сближения, исследователи обнаружили, что стресс мтДНК приводит к перестройке митохондриального близкородственного протеома, увеличивая связь митохондрий с лизосомальными и везикулярными белками. Среди них ретромерный комплекс, в частности VPS35, играет ключевую роль, извлекая митохондриальные компоненты. Ретромер способствует образованию везикул, полученных из митохондрий, которые перемещаются в лизосомы. Однако мтДНК напрямую перемещается в органеллу рециркуляции зависимым от BAX образом. Более того, при использовании модели дрозофилы с длинной делецией в мтДНК (ΔмтДНК), мы обнаружили, что ΔмтДНК активирует определенный профиль транскриптома для противодействия повреждению митохондрий. Здесь экспрессия Vps35 восстанавливает гомоплазмию мтДНК и устраняет связанные с ней дефекты. Таким образом, мы демонстрируем существование ранее неизвестного механизма контроля качества для митохондриального матрикса и важную роль лизосом в обороте мтДНК для устранения повреждения мтДНК.

Введение

Митохондрии — это многогранные органеллы, отвечающие за множество важных клеточных функций. Уникальные среди клеточных органелл, митохондрии содержат собственный геном, также известный как митохондриальная ДНК (мтДНК). Присутствующий в нескольких копиях на клетку, митохондриальный геном организован в структуры, известные как митохондриальные нуклеоиды. мтДНК относительно мала, но кодирует 13 критических белков, необходимых для митохондриальной дыхательной цепи, и подмножество РНК и тРНК, необходимых для синтеза митохондриальных белков. Все эти компоненты необходимы для поддержания митохондриальной функции и клеточного гомеостаза.

Одним из основных субпродуктов, образующихся при сопряжении различных митохондриальных путей для производства аденозинтрифосфата (АТФ), являются реактивные формы кислорода (РФК). РФК, к которым относятся супероксид-анионы, перекись водорода и гидроксильные радикалы, образуются, когда электроны выходят из цепи переноса электронов и реагируют с молекулами кислорода. РФК повреждают не только белки и липиды, но и мтДНК, меняя биохимические свойства молекулы, свойства сопряжения оснований, а также влияя на поддержание митохондриального генома, служа источником мутаций. Эти мутации повреждают комплексы дыхательной цепи, увеличивая окислительный стресс и запуская самоусиливающийся цикл, который приводит к дисфункции митохондрий. Таким образом, прогрессирующее накопление повреждений мтДНК влияет на многие заболевания человека, ускоряет старение и, в отмеченных случаях, даже приводит к клеточной смерти.

От производства энергии и ионного обмена до синтеза метаболитов, все функции митохондрий зависят от поддержания целостности сети посредством митохондриального обмена. С момента открытия избирательной деградации митохондрий у млекопитающих в начале 21 века было выявлено множество параллельных путей. Путь аутофагии PINK1-Parkin нацелен на крупные митохондриальные сегменты для деградации в ответ на острое повреждение или в ситуациях, требующих митохондриальной адаптации, например, во время дифференциации клеток или изменения доступности питательных веществ. Другие дополнительные пути работают параллельно, чтобы избирательно удалять только дисфункциональные митохондриальные части, тем самым сохраняя здоровые части сети и поддерживая клеточный гомеостаз.

Присутствие мтДНК в структурах, связанных с аутофагией, независимо от других митохондриальных частей, предполагает определенный избирательный путь "контроля качества" митохондриального генома. Было предложено несколько механизмов для объяснения того, как мтДНК деградирует в ответ на стресс, включая везикулы, полученные из митохондрий (MDV) и частичную митофагию. Тем не менее, точный механизм, по-видимому, зависит от начального стресса. Таким образом, при накоплении фумарата, митохондриальный геном оказывается инкапсулированным в MDV TOM20−/PDH+. При антимициновом/олигомициновом стрессе внутренняя мембрана и, в конечном итоге, мтДНК устраняются посредством лизосомально-зависимой пошаговой митофагии через поры VDAC1. Кроме того, клетки, обработанные низкими уровнями бромистого этидия, разделяют митохондриальные нуклеоиды на субдомены внутренней мембраны, которые при делении устраняются посредством аутофагосомно-зависимой пошаговой митофагии. В этом контексте внутренняя мембрана митохондрий PHB2 служит рецептором митофагии после деградации внешней митохондриальной мембраны. Независимо от специфики каждого пути, все они указывают на разделение митохондриальной части и ее деградацию в органеллах рециркуляции.

Вмешательство в репликацию мтДНК приводит к накоплению окислительных повреждений в митохондриальном геноме. Биохимические изменения, инициированные РФК, изменяют архитектуру митохондриальных мембран и позволяют транслокацию мтДНК в эндосомальный отсек, где она будет деградировать в органеллах рециркуляции. Недавно было обнаружено, что извлечение мтДНК отвечает за координацию между белками, перемещающимися через митохондриальную мембрану и везикулы. Эндосомальный белок RAB5C физически взаимодействует с митофузином 1 и митофузином 2 и способствует эндосомальному подходу и переносу мтДНК. Аналогично, для правильной утилизации мтДНК требуется белок митохондриальной мембраны SAMM50. Нарушение этого избирательного пути "контроля качества" приводит к активации врожденного иммунного ответа с потенциальными последствиями в виде старения и ряда заболеваний.

В текущем исследовании авторы стремились выяснить механизмы, лежащие в основе элиминации митохондриального генома при репликативном стрессе мтДНК. С помощью пространственной протеомики участков контакта митохондрий и эндосом они идентифицировали группу лизосомальных белков, участвующих в обороте мтДНК. Компоненты митохондриального матрикса, включая мтДНК, выходят из митохондриальной сети с помощью ретромера, хотя они и не следуют по одному и тому же пути. Накопление мтДНК вне митохондриального отсека зависит от BAX и усиливается при лизосомальном ингибировании хлорохином. Используя коррелятивную световую и электронную микроскопию (CLEM), авторы демонстрируют, что пошаговое удаление мтДНК из митохондрий происходит с прямым переносом в органеллу рециркуляции. Ретромер способствует этому процессу, стимулируя лизосомальную функцию и фрагментацию митохондрий. Кроме того, используя модель дрозофилы с длинной делецией в мтДНК (ΔмтДНК), удалось подтвердить роль ретромера в обеспечении контроля качества мтДНК in vivo. Результаты исследования раскрывают механизм деградации митохондриального матрикса, включая мтДНК, и выделяют лизосомы как центральные органеллы, поддерживающие митохондриальную функцию.

Результаты

Повреждение мтДНК изменяет протеом участков контакта митохондрий и эндосом

Нарушение механизма репликации мтДНК приводит к переносу митохондриальных нуклеоидов в эндосомальный отсек. Чтобы специально нарушить репликацию мтДНК, мы экспрессировали доминантную негативную мутацию митохондриальной геликазы Twinkle (TWNKK319E) в клетках HeLa. Эквивалентная мутация у мышей (TWNKK320E) была подтверждена как надежный инструмент для индукции изменений мтДНК, окислительного стресса и дефектов репликации. Экспрессия TWNKK319E снизила количество копий мтДНК через 48 часов после трансфекции.

Для обнаружения регуляторов, участвующих в этом пути, авторы использовали фермент беспорядочного биотинилирования TurboID. Для специфического обнаружения протеома митохондрий-эндосом они использовали Split-TurboID . Таким образом, им удалось слить N-концевую часть TurboID с RAB5C (TurboID аминокислоты 1-72; RAB5C-SplitTurboNt-V5) и C-концевую часть с SAMM50 (TurboID аминокислоты 73-246; SAMM50-SplitTurboCt-HA), двумя белками, связанными с эндосомальной утилизацией мтДНК. Ожидаемая субклеточная локализация обоих трансген-кодируемых белков слияния в эндосомах и митохондриях, соответственно, была подтверждена в клетках HeLa с помощью конфокальной микроскопии.

Для выделения большого количества биотинилированных белков исследователи создали стабильные линии клеток почки эмбриона человека (HEK) 293, экспрессирующие плазмиды Split-TurboID с помощью лентивирусной трансдукции. Восстановление активности биотинилирования было подтверждено вестерн-блоттингом и иммунофлуоресценцией. Было замечено, что клетки, экспрессирующие только SAMM50-SplitTurboCt-HA, проявляли остаточную ферментативную активность. Поэтому, чтобы минимизировать потенциальные фоновые помехи, авторы использовали эти клетки в качестве отрицательного контроля, а клетки, экспрессирующие как SAMM50-SplitTurboCt-HA, так и RAB5C-SplitTurboNt-V5, в качестве экспериментальных.

Близкородственный протеом митохондрий и эндосом в устойчивом состоянии показал обогащение белков, участвующих в транспорте внутри везикул Гольджи и импорте митохондриальных белков. Напротив, стресс репликации мтДНК вызвал полную перестройку протеома митохондрий-эндосом. Анализ путей выявил наличие белков митохондриального матрикса (галактокиназа, GALK1; компонент пируватдегидрогеназы, PDHX; фумаратгидратаза, FH) и нуклеоидных и митохондриальных внутренних мембранных белков (DNAJC11; прохибитин 2, PHB2; OXA1L), что указывает на разрыв митохондриальной внешней мембраны и последующее биотинилирование компонентов митохондриального матрикса. Кроме того, также были обнаружены белки, связанные с покрытыми оболочкой везикулами, такие как ретромерная субъединица VPS29 и RAB10, вместе с лизосомальными белками MYO1B, MYO6, ATP6V0D1 и катепсином D (CTSD). Таким образом, стресс мтДНК изменяет близкородственный протеом митохондрий в сторону лизосомального рекрутирования, чтобы облегчить деградацию митохондриальных компонентов.

Ретромер способствует фрагментации митохондрий при стрессе репликации мтДНК

Ретромер представляет собой тримерный белковый комплекс, образованный тремя компонентами: VPS35, VPS29 и VPS26, в основном изоформой VPS26A. Основная функция этого комплекса — контролировать перемещение везикул между эндосомами и лизосомами и способствовать их созреванию и деградационной активности. Однако, при определенных условиях, ретромер и, в первую очередь, его основной компонент, VPS35, участвуют в "контроле качества" митохондрий. В окислительной среде ретромер генерирует митохондриальные везикулы, направляемые в пероксисомы. При стрессе репликации мтДНК митохондриальный геном переносится в очаги ретромера. Как происходит эта транслокация, неясно.

Чтобы исследовать, как ретромер активирует пути контроля качества митохондрий во время стресса мтДНК, авторы сначала проанализировали его влияние на динамику митохондрий. Как описано, в стабильном состоянии экспрессия ретромерного компонента VPS29-зеленого флуоресцентного белка (GFP) формировала цитозольные очаги, колокализующиеся в других ретромерных компонентах, VPS35 и VPS26A, но не в митохондриях. Иммуноокрашивание другими везикулярными белками показало частичную колокализацию как с ранними (RAB5), так и с поздними эндосомами (LAMP1). TWNKK319E не изменил субклеточный рисунок ретромера внутри везикулярной сети. Тем не менее, была замечена более высокая колокализация VPS29 с митохондриями. Экспрессия VPS29-GFP, VPS35-GFP или TWNKK319E-mCherry по отдельности не оказала существенного влияния на морфологию митохондриальной сети. Аналогично, клетки, коэкспрессирующие как VPS29–GFP, так и TWNKK319E-mCherry, не показали никаких различий. Однако, клетки, коэкспрессирующие VPS35-GFP и TWNKK319E-mCherry, показали сильную фрагментацию митохондрий, наблюдаемую за счет увеличения количества митохондрий и уменьшения их среднего размера.

Далее авторы создали клетки с генным нокаутом (KO) CRISPR-Cas9 HeLa для каждой ретромерной субъединицы. Нокаут VPS26A не повлиял на другие ретромерные субъединицы. Напротив, нокаут VPS29 снизил уровень VPS35 и VPS26A в устойчивом состоянии. Нокаут VPS35 привел к повышению регуляции VPS29 и снижению VPS26A. Затем они проанализировали влияние нокаута на морфологию митохондрий. В устойчивом состоянии все три линии клеток с KO показали увеличенные количество митохондрий и митохондриальную область. В отличие от клеток дикого типа (WT), экспрессия TWNKK319E привела к удлинению митохондрий в клетках с KO VPS26 и VPS29, тогда как в клетках с KO VPS35 никакого эффекта не наблюдалось. Авторы задались вопросом, было ли отсутствие деления митохондрий, вызванное стрессом мтДНК и наблюдаемое при KO любой из трех ретромерных субъединиц, обусловлено сниженными уровнями VPS35 во всех моделях KO. Соответственно, повторная экспрессия VPS35 в VPS29 и VPS26 KO восстановила фрагментацию митохондрий. В совокупности эти данные показали, что ретромер необходим для митохондриального ответа на стресс репликации мтДНК, а его основной компонент VPS35, независимо от его дополнительных субъединиц, сохраняет способность фрагментировать митохондрии.

Ретромер облегчает высвобождение компонентов митохондриального матрикса во время митохондриального стресса.

Предложенный механизм ретромер-зависимого "контроля качества" митохондрий — образование MDV. MDV — это промежуточные структуры, образованные при различных типах стрессов и содержащие селективную нагрузку. До настоящего времени было описано много типов везикул, полученных из митохондрий. MDV содержат одну из двух митохондриальных мембран и обогащены для определенной гнарузки. Участие митохондриального фактора деления динамин-связанного белка 1 (DRP1), по-видимому, зависит от типа везикулы. Однако, MDV не зависят от белков, связанных с аутофагосомой.

Авторы сначала изучили наличие везикулоподобных структур, индуцированных ретромером и стрессом репликации мтДНК. В качестве внутреннего контроля они включили мутацию VPS35D620N, связанную с болезнью Паркинсона (БП), которая, как известно, ограничивает выбор нагрузки и митохондриальную чистоту. Поскольку митохондриальный геном находится в митохондриальном матриксе, они проверили наличие везикул, несущих пируватдегидрогеназу (ПДГ) и не содержащих белок внешней мембраны TOM20 (29). В устойчивом состоянии VPS35 не колокализовался с митохондриальными маркерами ПДГ или TOM20. Экспрессия TWNKK319E-mCherry индуцировала образование редких очагов TOM20−/PDH+, которые накапливались при лизосомальном ингибировании хлорохином. Очень мало везикул наблюдалось только при обработке хлорохином или экспрессии только VPS35-GFP. Это позволяет предположить, что они редко образовывались в устойчивом состоянии. Совместная экспрессия TWNKK319E и VPS35 увеличивала накопление очагов TOM20−/PDH+, которые колокализуются с поздним эндосомальным/лизосомальным маркером LAMP1.

Клетки, экспрессирующие VPS35D620N-GFP или клетки VPS35 KO, показали снижение везикул TOM20−/PDH+ . С другой стороны, экспрессия VPS29 не вызывала образования каких-либо типов митохондриальных везикул, что снова указывает на то, что VPS35 сохраняет возможность деления митохондрий. Более того, TWNKK319E не вызывал никаких везикул TOM20−/PDH+ без VPS29, хотя VPS35 все еще поступал в митохондрии.
Далее авторы задались вопросом, зависит ли образование этих везикулярных структур от механизмов MDV, в частности Miro1 (RHOT1) и DRP1. Чтобы проверить это, они создали клетки HeLa с KO гена Miro1 и экспрессировали TWNKK319E-mCherry вместе с VPS35-GFP. Хотя они обнаружили редкие очаги TOM20−/PDH+, их количество оставалось неизменным при стрессе репликации мтДНК. Аналогично, клетки HeLa с KO гена DRP1 показали минимальные независимые очаги TOM20−/PDH+. Примечательно, что клетки с KO DRP1 поддерживали удлиненную митохондриальную сеть даже при экспрессии TWNKK319E. Аналогично, клетки с KO Miro1 показали трубчатую сеть, которая стала агрегированной при стрессе репликации мтДНК.

Кроме того, авторы задались вопросом, происходит ли устранение митохондриального содержимого, опосредованное ретромером, также при вмешательстве в митохондриальную функцию другими способами. Учитывая, что стресс репликации мтДНК вызывает окислительное повреждение, и это одна из наиболее распространенных форм естественного приобретения мутаций мтДНК, они обработали клетки сублетальной концентрацией H2O2. Параллельно они также выращивали клетки в галактозе, состоянии, которое поддерживает митохондриальный метаболизм и окисление. Таким образом, авторы наблюдали образование очагов TOM20−/PDH+, обогащенных при ингибировании лизосомальной функции хлорохином. Опять же, эти частицы не были обнаружены при экспрессии мутации VPS35D620N, связанной с PD

Недавно был описан механизм, участвующий в устранении внутренней мембраны митохондрий, а иногда и мтДНК, который следует за образованием везикул через поры VDAC1 . Однако при стрессе репликации мтДНК иммуноокрашивание внутренней субъединицы митохондриальной мембраны V комплекса АТФазы (аденозинтрифосфатазы), ATP5A, не выявило очагов, независимых от белка внешней мембраны TOM20.

В совокупности эти результаты подтверждают, что нисходящий ответ на стресс репликации мтДНК включает митохондриальную везикуляцию, контролируемую генами Miro1 и DRP1, независимо от везикул, полученных из внутренней мембраны (VDIMs). Стресс репликации мтДНК следует за активацией лизосомально-зависимых механизмов "контроля качества" митохондриального матрикса, которые связаны с образованием везикул, что напоминает путь MDV.

Выброс мтДНК во время стресса мтДНК происходит непосредственно в везикулы из эндосомальной системы

Авторы исследовали, следует ли элиминация митохондриального генома по тому же пути, который наблюдается для компонентов митохондриального матрикса. Они обнаружили VPS35-GFP в выходных участках как PDH, так и мтДНК. Чтобы исследовать роль ретромера в извлечении мтДНК, авторы создали клетки, стабильно экспрессирующие VPS35-V5. Количественный анализ полимеразной цепной реакции (qPCR) генов мтДНК во фракциях без митохондрий показал повышенные MT-ND1 и MT-ND5 в клетках со стрессом репликации мтДНК. Сверхэкспрессия VPS35 еще больше увеличила извлечение, тогда как в клетках с доминантным отрицательным VPS35D620N никаких изменений не наблюдалось. Последовательно, коэкспрессия TWNKK319E и VPS35 увеличивала количество очагов цитозольных двухцепочечных ДНК (dsDNA), которые дополнительно обогащались при лизосомальном ингибировании хлорохином. Напротив, клетки, экспрессирующие VPS35D620N, демонстрировали меньше внемитохондриальной dsDNA. Неожиданно, но клетки сKO гена Miro1 также демонстрировали немитохондриальные очаги dsDNA. Примечательно, что анализ MDV в клетках, трансфицированных mtDNA-Kaede, показал очаги либо TOM20−/PDH+, либо TOM20−/mtDNA+, и почти никаких везикул TOM20−/PDH+/dsDNA+. Эти данные свидетельствуют о том, что, хотя MDV митохондриального матрикса и высвобождение мтДНК активируются при стрессе репликации мтДНК, высвобождение мтДНК происходит независимо от везикуляции митохондриального матрикса.

Таким образом, было проведено исследование того, способствуют ли митохондриальные поры высвобождению мтДНК. Клетки, обработанные ингибитором VDAC1 VBIT-12 в сочетании с хлорохином, не показали никаких изменений в количестве цитозольных очагов dsDNA. Напротив, обработка пептидом V5, ингибирующим BAX, показала значительное снижение количества немитохондриальных очагов dsDNA. Эти данные оспаривают представление о высвобождении мтДНК, опосредованном везикулами, предполагая, что при стрессе репликации мтДНК митохондриальный геном может высвобождаться непосредственно в цитоплазму. Чтобы визуализировать цитозольные очги dsDNA в высоком разрешении и получить информацию о клеточном контексте, авторы провели CLEM и объединили его с электронной томографией. Они окрасили обработанные хлорохином клетки с помощью SYBR Gold для визуализации ДНК, а также при помощи PK Mito Deep Red для визуализации митохондрий. В отличие от контрольных клеток, клетки, экспрессирующие TWNKK319E-mCherry, показали цитозольные очаги ДНК. Эти клетки показали уменьшенный размер митохондрий и меньшее количество крист на митохондрию. Корреляция конфокальных изображений с трансмиссионной электронной микроскопией и электронной томографией показала, что области, содержащие цитозольную двухцепочечную ДНК, были обогащены органеллами рециркуляции на разных стадиях созревания. Ни одна из клеток, проанализированных с помощью CLEM (n = 6), не показала ДНК внутри небольшой независимой свободной цитозольной везикулы или без мембраны в цитоплазме. Затем авторы применили тот же подход в клетках, экспрессирующих TWNKK319E-mCherry и VPS35–циановый флуоресцентный белок (CFP). Эксперименты по корреляции показали присутствие VPS35-CFP в том же типе органеллы рециркуляции, содержащей электронно-плотный материал и в близком расположении с митохондриями. Реконструкция с помощью электронной томографии одного выходного участка мтДНК подтвердила перенос мтДНК в одну из этих близлежащих везикул, также помеченных VPS35-CFP. Соответственно, иммуноокрашивание клеток TWNKK319E-mCherry показало повышенное количество двухцепочечной ДНК, контактирующей с лизосомальным/поздним эндосомальным маркером LAMP1.

Активные лизосомы способствуют обмену мтДНК

Одной из основных функций ретромерного комплекса является созревание ранних эндосом в поздние эндосомы/лизосомы. В клетках HeLa ретромер способствует обработке лизосомальных гидролаз, влияя на морфологию и функцию лизосом. Лизосомы — это высокодинамичные органеллы, которые быстро перемещаются в клетках, адаптируя деградативную способность клеток к клеточным потребностям. Расположение лизосом внутри клетки влияет на их активность и взаимодействие с другими органеллами. Перинуклеарные лизосомы обычно участвуют в деградации, тогда как те, что находятся на периферии, функционируют в эндоцитарных процессах. Rab-гуанозинтрифосфатазы (ГТФазы) координируют работу с ретромерным комплексом, регулируя позиционирование и транспортировку лизосом.

Одним из белков, которые мы идентифицировали с помощью проксимальной протеомики, был RAB10. При различных стимулах RAB10 влияет на распределение лизосом между перинуклеарной областью и периферией клетки, тем самым влияя на такие клеточные процессы, как аутофагия и лизосомальная деградация. При деполяризации митохондрий RAB10 связывается с рецептором аутофагии оптинеурином и способствует его накоплению, тем самым облегчая митофагию.

Чтобы определить, как RAB10-лизосомы участвуют в нисходящем ответе на стресс мтДНК, авторы использовали экспрессию трех различных аллелей: RAB10 WT, аллеля усиления функции RAB10Q68L и доминантного отрицательного RAB10T23N. Активность RAB10 зависит от его статуса связывания с ГТФ (гуанозинтрифосфатом). Хотя аллель WT может переходить из активной в неактивную форму, мутация усиления функции всегда остается активной, в отличие от доминантной негативной мутации, которая всегда остается неактивной. Поэтому ожидается, что изменения, вызванные RAB10, будут усилены для аллеля RAB10Q68L.

Соответственно, стресс репликации мтДНК увеличил ассоциацию RAB10Q68L-GFP с ретромером, указывая на активацию лизосомо-зависимого пути к деградации. Количественный анализ морфологии митохондрий показал, что при стрессе репликации мтДНК клетки, экспрессирующие WT RAB10 или аллель усиления функции RAB10Q68L, демонстрируют увеличенное количество митохондрий и их уменьшенный средний размер, более выраженный для аллеля усиления функции. Однако никаких изменений не было обнаружено в клетках, экспрессирующих доминантный негативный вариант.

Затем авторы исследовали субклеточную локализацию RAB10 при стрессе мтДНК. В устойчивом состоянии RAB10 частично локализовался с поздними эндосомами, но в этих частицах не удалось обнаружить двуцепочечную ДНК. При стрессе репликации мтДНК RAB10 накапливался в LAMP1-положительных поздних эндосомах вместе с внемитохондриальной двуцепочечной ДНК. В соответствии с этим, была усилена колокализация между RAB10 и LAMP1, а также между LAMP1 и двуцепочечной ДНК. Раскрывающие эксперименты с RAB10-GFP подтвердили сильную связь с LAMP1 при стрессе мтДНК. Подводя итог, на основе этих данных можно заявить, что нисходящий ответ, связанный со стрессом репликации мтДНК, регулируется активными RAB10 лизосомами.

Образование длинных делеций мтДНК в эпидермисе личинок дрозофилы

Наши результаты показывают, что ретромер усиливает специфические механизмы контроля качества мтДНК. Авторы предположили, что сверхэкспрессия VPS35 также может быть полезна in vivo, снижая митохондриальную нагрузку, связанную с мутациями мтДНК. Для проверки своей гипотезы они использовали хорошо зарекомендовавшую себя модель Gal4/upstream activated sequence (UAS) дрозофилы, основанную на нуклеазах. МтДНК дрозофилы содержит два целевых сайта для рестриктазы Afl III. Совместная экспрессия митохондриально-ориентированного Afl III (mitoAfl III) и ДНК-лигазы из фага T4 (mitoT4lig) приводит к образованию делеции размером 2564 пар оснований (по) в мтДНК, включая ген CytB (мтДНКΔ10,789-13,372).

Одновременная индукция обеих конструкций UAS (UAS-mitoAfl III, UAS-митоЛигаза) большинством протестированных драйверов Gal4 (нейроны, эпителиальные, мышечные или жировые тельца) приводит к эмбриональной или ранней личиночной летальности. Соответственно, при индукции, опосредованной личиночным эпидермальным драйвером A58 при 25°C (A58-Gal4 > UAS-mitoAflIII, UAS-митоЛигаза; с этого момента Epi-ΔmtDNA), только несколько личинок смогли выжить до стадии куколки. Чтобы преодолеть летальность, авторы поддерживали скрещивания при 18°C. При этой температуре активность Gal4 находится на самом низком уровне, что обеспечивает выживание личинок до стадии куколки. При этой температуре было замечено наличие ограниченных хромогенных очагов, но личинки могли достичь окукливания, хотя появились только ~1% куколок. Следовательно, эта температура и личинки L3 были выбраны для дальнейших экспериментов.

Было подтверждено, что экспрессия mitoAfl III достигает пика на ранней стадии L3 и спадает на средней стадии (L3-E по сравнению с L3-M). Обычная ПЦР с использованием олигонуклеотидов, фланкирующих мтДНКΔ10.789-13.372, подтвердила наличие делеции мтДНК в Epi-ΔмтДНК. Соответственно, соотношение CytB/ND5 было снижено, а число копий мтДНК уменьшилось в большей степени, когда CytB, включенный в делецию мтДНКΔ10.789-13.372, использовался для количественной оценки числа копий мтДНК. Анализ вестерн-блоттинга из общих белковых экстрактов показал равные уровни субъединицы митохондриального комплекса II сукцинатдегидрогеназы B (SDHB) и истощение субъединицы комплекса V ATPA. Учитывая, что митохондриальный комплекс II кодируется ядерными генами, а комплекс V как ядерными, так и митохондриальными геномами, этот результат подтвердил, что истощение мтДНК было связано не с уменьшением массы митохондрий, а с меньшим количеством копий мтДНК. Таким образом, коэкспрессия mitoAfl III и mitoT4lig в эпидермисе личинок дрозофилы эффективно удаляет мтДНК и увеличивает гетероплазмию мтДНК.

VPS35 способствует очистке мтДНК in vivo

Чтобы проверить, поддерживает ли повышение Vps35 очистку мтДНК in vivo, авторы сверхэкспрессировали Vps35 в личиночном эпидермисе путем скрещивания линии UAS-Vps35 с драйвером A58-Gal4 (Epi-Vps35OE). Личинки Epi-Vps35OE не проявляли макроскопических аномалий без наблюдаемых морфологических или развивающих дефектов. Количественная оценка ПЦР общего количества экстрактов РНК выявила девятикратное увеличение мРНК Vps35. Кроме того, личинки Epi-Vps35OE имели умеренное, но значительное увеличение числа копий мтДНК. Затем авторы сгенерировали Epi-ΔмтДНК-Vps35OE. На этом фоне уровни мРНК Vps35 были увеличены в среднем в пять раз по сравнению с Epi-ΔмтДНК (рис. S6F). Они не наблюдали серьезных макроскопических и морфологических отклонений у личинок, а хромогенные очаги, изначально наблюдавшиеся у личинок Epi-ΔmtDNA, исчезли. Количественная оценка числа копий мтДНК и соотношения CytB/ND5 показала нормализованные копии мтДНК у Epi-ΔmtDNA-Vps35OE по сравнению с контрольными личинками. Более того, данные вестерн-блоттинга подтвердили более высокие уровни белка комплекса V ATPA и отсутствие изменений в кодируемом ядром белке комплекса II SDHB.

Наконец, авторы исследовали изменения в ультраструктуре митохондрий, вызванные этими генетическими модуляциями. Электронно-микроскопический препарат эпидермиса личинок показал аберрации крист в эпидермисе животных Epi-ΔmtDNA. Кроме того, было замечено накопление лизосом и мультивезикулярных тел, интеркалированных митохондриями. Epi-Vps35OE на фоне Epi-ΔmtDNA показал полное восстановление ультраструктуры митохондрий, аналогичное контрольным личинкам.

Повышенный уровень Vps35 меняет профиль транскриптома в эпидермисе личинок ΔmtDNA

Для беспристрастного полногеномного обзора различных путей, активированных в эпидермисе ΔmtDNA, авторы провели транскриптомный анализ изолированного эпидермиса личинок L3 ΔmtDNA. Как и ожидалось, из-за наличия делеции mtDNAΔ10.789-13.372, митохондриальные мРНК для генов CytB, ND1 и lrRNA, включенных в делецию, были сильно снижены. Затем авторы провели дифференциальный анализ экспрессии с использованием четырех независимых биоинформатических методов (EdgeR-QFL, EdgeR-LRT, limma-voom и DESeq2) и идентифицировали 541 ген со значительной повышенной регуляцией, тогда как регуляция 311 генов была понижена. Анализ путей с помощью DAVID (база данных для аннотаций, визуализации и комплексного обнаружения) и Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) с путями Gene Ontology (GO) выявил повышенную регуляцию протеолиза, врожденного иммунного ответа и путей окислительно-восстановительного контроля. Для дальнейшей проверки этих данных авторы выбрали некоторые из мишеней с повышенной регуляцией и провели анализ методом количественной ПЦР в независимых изолятах РНК. Они обнаружили последовательное обогащение генов глутатион-S-трансферазы GstD2, GstD5, GstD9, GstE5, GstE7 и Gst9, а также митохондриальных протеаз Spg7 и Afg3l2. Epi-Vps35OE в наследственности личинок Epi-ΔmtDNA изменил все уровни мРНК для выбранных мишеней на нормальные.

Повышение уровня VPS35 поддерживает лизосомальную функцию, не влияя на макроаутофагию

Чтобы понять молекулярные механизмы, с помощью которых VPS35 восстанавливает функцию митохондрий, авторы снова обратились к клеткам человека. Учитывая, что ретромер участвует в лизосомальном гомеостазе, они предположили, что более высокие уровни VPS35 улучшат пути клеточной деградации. Окрашивание LysoTracker в клетках, экспрессирующих VPS35-V5 и TWNKK319E-mCherry, показало большее количество частиц кислоты, чем в контрольных клетках. В соответствии с этим, в клетках с KO гена VPS35 количество очагов кислоты было снижено.

Далее авторы задались вопросом, связаны ли эти эффекты pH лизосом с повышенной экспрессией VPS35, а также с изменениями в макроаутофагии. Вестерн-блот-анализ маркеров аутофагии показал повышенные уровни LC3B-II и p62 в устойчивом состоянии в клетках, сверхэкспрессирующих VPS35-V5. Эксперименты с потоком аутофагии в обработанных хлорохином клетках не выявили различий в накоплении LC3B-II, но клетки со сверхэкспрессией VPS35 показали небольшое увеличение адаптерного белка p62 и самого VPS35. В то же время лизосомальный маркер LAMP1 был сильно обогащен в клетках VPS35.

Конфокальная микроскопия показала повышенную ассоциацию митохондрий с поздними эндосомами LAMP1 в клетках со сверхэкспрессией VPS35. Авторы задались вопросом, транслируется ли эта повышенная ассоциация в увеличение макроаутофагии полных митохондрий. Таким образом, они трансдуцировали клетки с помощью mitoKeima, флуоресцентного репортера с pH-зависимым профилем возбуждения флуоресценции. В митохондриях mitoKeima имеет пик возбуждения при 448 нм, тогда как в лизосомах из-за кислого pH пик возбуждения смещается до 561 нм. В обоих случаях флуоресцентное излучение остается на 610 нм. Ратиометрический анализ флуоресцентного излучения mitoKeima при последовательном возбуждении на 586 нм/440 нм показал снижение объемной митофагии для клеток, сверхэкспрессирующих VPS35. Все эти данные в совокупности подтверждают, что повышение VPS35 не влияет на общие пути аутофагии, включая объемную митофагию. Однако он стимулирует лизосомальную функцию при стрессе, ускоряя поэтапное удаление митохондриальных компонентов и облегчая восстановление после повреждения мтДНК.

Обсуждение

"Контроль качества" митохондрий служит спасательным путем для устранения плохо функционирующих митохондрий. Как и другие митохондриальные компоненты, митохондриальный геном также склонен к накоплению повреждений. Однако постоянный стресс репликации мтДНК не запускает массовое удаление митохондрий, а скорее приводит к деградации митохондриальных нуклеоидов в эндосомальном компартменте, выступая в качестве селективного пути деградации для митохондриального генома.

Существование альтернативных или специфичных для нагрузки путей митофагии подчеркивает сложность и адаптивность клеточных систем. Дисфункциональные митохондриальные части могут быть точно устранены путем сохранения остальной части митохондриальной сети. Различные исследования показали, что эти пути имеют общие компоненты с системой транспортировки везикул. Например, в окислительной среде ретромер вызывает образование MDV, содержащих окисленную нагузку и направленных в пероксисомы. Тем не менее, хотя при стрессе мтДНК в клеточных деградационных отсеках появились ретромер и митохондриальный геном, не было ясно, следует ли этот путь за MDV.

Чтобы определить конкретный механизм, участвующий в обороте митохондриального генома при стрессе репликации мтДНК, авторы использовали направленную близкородственную протеомику между митохондриями и эндосомами. В соответствии с предыдущими выводами, было обнаружено обогащение везикулярных и лизосомальных белков, включая RAB10, ATP6V0D1, MYO1B, BIRC6, а также ретромерный компонент VPS29. Все эти белки участвуют в созревании и закислении лизосом, что предполагает важную роль лизосом в устранении митохондриального генома.

Эти данные подтверждают модель, в которой события, следующие за стрессом мтДНК, протекают через параллельные пути, строго регулируемые везикулярной системой. Стресс репликации мтДНК в первую очередь приводит к фрагментации митохондрий. Данный процесс может способствовать разделению дисфункциональных митохондриальных компонентов. Таким образом, деление митохондриальной сети ингибируется в клетках, экспрессирующих доминантный отрицательный аллель RAB10T23N, и в клетках с дефицитом ретромера. Тем не менее, роль этих двух кандидатов в адаптации динамики митохондрий к стрессу не нова. С одной стороны, RAB10, традиционно связанный с транспортом везикул и морфологией эндоплазматического ретикулума, также контролирует оборот митохондрий при деполяризации. С другой стороны, ретромер вызывает фрагментацию митохондрий зависимым от DRP1/DLP1 образом. Таким образом, доминантная негативная мутация VPS35D620N вызывает митохондриальную фрагментацию, зависящую от VPS26, из-за повышенного оборота митохондриального DRP1. Соответственно, KO ген VPS35 в клетках HeLa подавлял митохондриальную фрагментацию, вызванную стрессом репликации мтДНК. Фрагментация сети восстанавливалась при повторной экспрессии VPS35, независимо от дополнительных субъединиц VPS29 или VPS26.

Более того, стресс репликации мтДНК запускает образование канонических MDV, содержащих компонент митохондриального матрикса PDH. Образование этих везикул также зависит от ретромера и требует белка деления митохондрий DRP1 и транспортного белка Miro1, которые критически важны для образования MDV. Примечательно, что эти везикулы, полученные из матрикса, отличаются от недавно описанных VDIM, которые образуются независимо от DRP1. Неожиданно, доставка мтДНК в эндосомы не следует пути, связанному с MDV. Напротив, оборот мтДНК зависит от ретромера и, по крайней мере, от связанного с Bcl-2 белка X BAX. Таким образом, привлечение ретромерных везикул к поверхности митохондрий может активировать образование макропор BAX-BAK1, что обеспечивает грыжеобразование внутренней мембраны митохондрий и выдавливание больших фрагментов мтДНК с последующим захватом в везикулы. Затем ретромер и другие связанные с везикулами белки, такие как RAB10, могут способствовать созреванию лизосом и деградации поврежденной мтДНК.

Поскольку сверхэкспрессия ретромерного компонента ядра VPS35 увеличивает экстракцию мтДНК in vitro, авторы предположили, что это также будет полезно для устранения митохондриальной нагрузки in vivo. Примечательно, что было показано, что сверхэкспрессия VPS35 восстанавливает клеточный гомеостаз, связанный с лизосомальной дисфункцией. Таким образом, присутствие ΔмтДНК изменяет митохондриальное окислительно-восстановительное состояние, что транслируется в активацию путей детоксикации. Эти изменения активируют определенный профиль транскриптома для противодействия клеточному повреждению, а также для изменения структуры митохондрий. Таким образом, помимо повышения регуляции генов метаболизма глутатиона и врожденного иммунного ответа, было обнаружено повышение регуляции многих транскриптов, кодирующих мембранные переносчики, такие как члены аквапорина (Drip), транспортеры ABCB (Mdr49 и Mrp4), ионные каналы (aralar1, MME1, sCaMC и TrpA1) и митохондриальные протеазы (Lon, Afg3L2 и Spg7). Последние три участвуют в деградации поврежденных митохондриальных белков для поддержания целостности митохондрий. В этом контексте сверхэкспрессия Vps35 у дрозофил восстанавливает митохондриальные дефекты, связанные с поврежденной мтДНК, а также восстанавливает клеточный транскриптом, тем самым предполагая восстановление клеточного здоровья.

Вместе эти данные подчеркивают сложную связь между митохондриями и лизосомами и то, как эти две органеллы координируют работу для поддержания здоровья клеток. Соответственно, нарушение работы митохондрий приводит к увеличению лизосомального биогенеза, лизосомального закисления и оборота митохондрий. Аналогичным образом было обнаружено, что в клетках экспрессия VPS35 не влияет на макроаутофагию, но напрямую влияет на лизосомальное закисление при стрессовой нагрузке мтДНК.

В заключение, авторы представили механистический взгляд на сложный механизм. Стресс репликации мтДНК следует за сложной нисходящей реакцией, которая синергически предотвращает накопление повреждений в мтДНК и обеспечивает целостность митохондрий. Во-первых, выявлена важная роль везикулярной системы в контроле динамики митохондрий. Во-вторых, MDV, направленные в лизосомальный компартмент, устраняют митохондриальный матрикс. Наконец, для вытекшей мтДНК требуется образование митохондриальных пор мембраны BAX. Однако выброшенная ДНК не существует в цитоплазме в свободном виде, а захватывается органеллой рециркуляции. Авторы демонстрируем in vivo, что ретромер может управлять устранением мутировавшей мтДНК, удаляя источник клеточной нагрузки и тем самым модулируя нисходящий ответ. Таким образом, эти данные подтверждают, что модуляция уровней VPS35 является эффективной стратегией противодействия повреждению митохондрий, связанному с ΔмтДНК.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Основной целью этого исследования было понять, как митохондриальный геном попадает в органеллы рециркуляции при стрессе репликации мтДНК. Сначала авторы разработали подход для расшифровки близкородственного протеома митохондрий и эндосом. Чтобы помешать репликации мтДНК, они использовали экспрессию миссенс-мутации хеликазы мтДНК, зная, что в репликативных клетках это приводит к лизосомально-зависимому истощению мтДНК. Результаты исследоания позволили определить подмножество белков-кандидатов, участвующих в регуляции этого процесса, особенно выделяя лизосомы. Таким образом, авторы выбрали ретромер и оценили его роль в митохондриальной динамике и механизмах извлечения компонентов митохондриального матрикса. Наконец, они исследовали in vivo способность ретромера увеличивать круговорот митохондрий, для чего использовали модель дрозофилы со специфическим изменением в мтДНК.

Генерация плазмид
Плазмиды RAB10 были получены из Addgene (WT, Addgene #49472; Q68L Addgene #49544; и T23N Addgene #130885). RAB10T23N был субклонирован в pEGFP-C1 с использованием Bgl II и Eco RI. VPS35-EGFP и VPS35-CFP были получены путем субклонирования VPS35 из плазмиды pLenti/V5/DEST-VPS35 (Addgene #21691) в плазмиде pEGFP-N1 и pECFP-N1 с использованием регионов Xho I и Bam HI. Открытая рамка считывания (ORF) белка Twinkle Homo sapiens была субклонирована из Twinkle-APEX2-V5 (Addgene #129705) в pN1-mCherry с использованием регионов Bgl II и Eco RI. VPS35 p.D620N и Twinkle p.K319E были получены с помощью регион-направленного мутагенеза. VPS29-YFP (желтый флуоресцентный белок) был получен из Addgene (#174520) и субклонирован в pEGFP-C1 с использованием регионов клонирования Eco RI и Bam HI. MitoKeima был амплифицирован из mKeima-Red-Mito-7 (Addgene #56018) и субклонирован в pLenti-CMV-Puro в регионах EcoR V. Все полученные плазмиды были проверены секвенированием по Сэнгеру. Для создания стабильных линий клеток ORF VPS35 или VPS35 p.D620N были субклонированы в pLenti/V5/DEST с использованием регионов EcoR V. Плазмида mtDNA-Kaede была подарена Т. Шаттом (Университет Калгари, Канада).

Генерация клеточных линий KO клеток HeLa
Все клеточные линии KO были получены с помощью CRISPR-Cas9 и клонирования специфических направляющих РНК (гРНК) в pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 (Addgene #62988) на сайте Bbs I. Все гРНК были разработаны с использованием http://crispor.tefor.net/crispor.py. VPS35 KO был получен путем нацеливания на экзон 13 (ATATGAATTCATGTCC); VPS26A был отключен с помощью гРНК, специфичной для экзона 4 (GCACCGATGTAAGATTCATA), и VPS29 путем нацеливания на изоформу 1 (GGCAAACTGTTGCACCGGTG), изоформу 2 (GGACATCAAGTTATTCCATG) и изоформу 3 одновременно (GACTATCTCAAGACTCTGGC). Miro1 (RHOT1) KO был получен путем одновременного нацеливания на экзон 10 (GGGACTGTGCTTCGACGATT) и экзон 12 (GTGGCCCCCAAGGTATGTAA). Во всех случаях трансфицированные клетки отбирались с использованием пуромицина (2,5 мкг/мл; Sigma-Aldrich, #P8833) в течение 72 часов после трансфекции, после чего проводилась изоляция моноклональных клеточных линий.

Культура клеток и химическая обработка Клетки поддерживались в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) с глюкозой (4,5 г/литр) + GlutaMAX (Gibco, #10566016) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1x Pen/Strep (Gibco, #15070063) и плазмоцина (2,5 мкг/мл; InvivoGen, #ant-mpp). Трансфекция клеток HeLa достигалась с помощью FuGENE HD (Promega, #E2311) в соответствии с инструкциями производителя и сменой среды выращивания через 6 часов после трансфекции. Лизосомальную активность ингибировали 10 мкМ хлорохина (Sigma-Aldrich, #C6628) в течение 4 часов, где это указано. Окислительное повреждение было вызвано обработкой клеток 200 мкМ H2O2 в полной среде в течение 4 часов. Для стимуляции митохондриального метаболизма клетки выращивали в течение ночи в неглюкозной среде DMEM, дополненной 10 мМ галактозы (Sigma-Aldrich, #1287700), 10% FBS, 1x Pen/Strep, 1x GlutaMAX (Gibco, #35050061) и 1x пирувата (Gibco, #11360070). Для ингибирования образования пор митохондриальной мембраны через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 25 мкМ VBIT-12 (MedChemExpress, #HY-135885) или 100 мкМ ингибитором пептида Bax V5 (MedChemExpress, #HY-P0081) вместе с хлорохином в течение 4 часов перед фиксацией. Для получения стабильных линий клеток клетки HeLa трансдуцировали pLenti/V5/DEST-VPS35, pLenti/V5/DEST-VPS35 p.D620N и pLenti-CMV-Puro-mitoKeima с использованием psPAX2 и pMD2.G в качестве вспомогательных плазмид и клеток HEK293 для вирусной упаковки. Супернатант, содержащий лентивирус, фильтровали через фильтр 0,45 мкм и дополняли полибреном (10 мкг/мл; Sigma-Aldrich, #H9268). Трансгенная экспрессия VPS35 была подтверждена вестерн-блоттингом. Трансдуцированные клоны отбирали и поддерживали в среде, содержащей бластицидин S (20 мкг/мл; InvivoGen, #ant-bl-05) для клеточных линий со сверхэкспрессией VPS35 и пуромицин (2,5 мкг/мл) для митокеймы. Клетки HeLa DRP1 KO были любезно предоставлены М. Эскобаром (Университет Кельна, Германия).

Штаммы дрозофил Система Gal4/UAS использовалась для тканеспецифической экспрессии. Все эксперименты с дрозофилами проводились с использованием линий драйверов A58-Gal4 для индукции UAS-конструкций в эпидермисе личинок дрозофлы. A58-Gal4 экспрессируется в эпидермисе, начиная с первой личиночной стадии. В этой работе использовались следующие UAS-конструкции: UAS-mitoT4lig, UAS-mitoAflIII (BL 84979), UAS-mitoAflIII, UAS-mitoT4lig/CyO (любезно предоставлено B. A. Hay) и UAS-Vps35.HA (BL67152). Все популяции имели генетическую наследственность белых глаз и содержались при температуре 25°C при 12-часовом/12-часовом цикле свет/темнота на стандартном корме для мух. Все помеси были созданы и содержались при температуре 18°C ​​при 12-часовом/12-часовом цикле свет/темнота на стандартном корме для мух. Все молекулярные эксперименты с использованием дрозофил проводились с использованием полных личинок, за исключением анализа транскриптома, где был изолирован личиночный эпидермис.

Количество копий мтДНК и qPCR Общая ДНК была выделена с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, #69504) в соответствии с инструкциями производителя. Двадцать нанограмм общей ДНК было использовано для анализа пороговых различий амплификации между мтДНК и ядерной ДНК [метод delta C(t)]. Для анализа на основе клеток человека (HS) количество копий мтДНК было получено с помощью олигонуклеотидов, амплифицирующих митохондриальный ген ND1 и ядерный ген APP.

Для обнаружения цитозольной мтДНК клетки HeLa, стабильно экспрессирующие VPS35 или VPS35D620N, были трансфицированы TWNKK319E-mCherry. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки были собраны и поровну разделены для внутреннего контроля и экспериментов по фракционированию. Общую ДНК для образцов внутреннего контроля получали путем растворения клеточных осадков в 10 мМ NaOH с последующим кипячением при 98°C в течение 30 мин и нейтрализацией pH с помощью Tris (pH 8) до конечной концентрации 150 мМ. Для фракций без митохондрий клеточные осадки инкубировали в дигитонине (25 мкг/мл; Roth, #4005.2), 150 мМ NaCl и 50 мМ Hepes (pH 7,4) в течение 10 мин на льду. Неразрушенные клетки и митохондрии очищали последовательным дифференциальным центрифугированием сначала при 1000 g, а полученный супернатант — при 14 000 g. ДНК далее выделяли с помощью набора DNeasy Blood & Tissue Kit и элюировали в равных объемах. Три микролитра чистой ДНК были использованы для амплификации ядерного гена APP и митохондриальных генов ND1 и ND5 в обеих фракциях. Цитоплазматическое содержание мтДНК было получено после нормализации каждого значения Ct из фракций без митохондрий к нормализованному значению общего образца Ct (Ct MitochondrialMITOC.Free) − (Ct MitochondrialTOTAL − Ct NuclearTOTAL) = DDCt. Значения кратности изменения (FC) были получены с 2^−DDCt.

Для количественной оценки гетероплазмии мтДНК и числа копий мтДНК у дрозофил 20 нг общей ДНК, выделенной из пяти личинок, были использованы для амплификации ND5 и CytB, митохондриальных генов снаружи и внутри удаленной области соответственно, и 3RTub (TUBB) в качестве ядерного гена. Оба значения Ct из митохондриальных генов были нормализованы с Ct для TUBB, и было рассчитано соотношение между CytB/ND5. Количественная ПЦР в реальном времени для экспрессии генов была выполнена с использованием кДНК, ретротранскрибированной с 1 мкг общей РНК с использованием PowerUP SYBR green (Thermo Fisher Scientific, #A25780). Все эксперименты с qPCR были выполнены в Quant Studio 1 (Thermo Fisher Scientific) и PowerUP SYBR Green (Thermo Fisher Scientific, #A25780). Традиционная ПЦР была выполнена с использованием либо кДНК, либо общей ДНК.

Вестерн-блоттинг и иммунофлуоресценция Для выделения белка клетки осаждали в указанные временные точки и ресуспендировали в буфере для радиоиммунопреципитации (RIPA) [150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 50 мМ трис-HCl (pH 8), 1 мМ EDTA и 0,5% Na-дезоксихолата], содержащем ингибитор протеазы (Sigma-Aldrich, #11697498001). Концентрацию белка количественно определяли с помощью реагента Брэдфорда (Bio-Rad, #5000001), и равные количества белка загружали на электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) с SDS, переносили на мембрану из поливинилидендифторида (Bio-Rad), блокировали в TBST–5% обезжиренном молоке и блотировали с указанными антителами. Для вестерн-блоттинга дрозофил пять личинок L3 были гомогенизированы в буфере лизиса [150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 50 мМ трис-HCl (pH 8), 0,01% NP-40 и 1 мМ EDTA], содержащем ингибитор протеазы, с использованием тефлонового пестика. Равные количества белков были напрямую загружены в SDS-PAGE и обработаны, как описано выше.

Для вестерн-блоттинга использовались следующие антитела: поликлональные α-SDHB (10620-1-AP; 1:1000), α-TOM20 (11802-1-AP; 1:1000), α-оптинейрин (10837-1-AP; 1:1000) α-LC3B (14600-1-AP; 1:1000), α-GFP (50430-2-AP; 1:1000), α-VPS26A (12804-1-AP; 1:1000), α-Miro1 (#84055-5-RR; 1:1000) и моноклональные α-GAPDH (60004-1-Ig; 1:4000), α-GFP (66002-1-Ig; 1:1000) и α-p62 (66184-1-Ig; 1:1000) от Proteintech; поликлональные α-RAB5 (ab109534; 1:1000), α-VPS29 (ab236796; 1:1000) и моноклональные α-ATP5A (ab14748; 1:1000) от Abcam; поликлональные α-LAMP1 (#9091; 1:1000), α-V5 (#13202; 1:1000) и моноклональные α-V5 (#80076; 1:1000) от Cell Signaling; моноклональные α-VPS35 (sc-374372; 1:1000) и α-RAB5 (sc-46692; 1:500) из Santa Cruz; моноклональные α-DLP1(DRP1) из BD Bioscience (#611112; 1:500). Все мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами в сочетании с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson ImmunoResearch; козьи антитела к мышиным иммуноглобулинам #115-035-003; козьи антитела к кроличьиим имунноглобулинам #111-035-003), разработанными с использованием Western Lighting Plus ECL (PerkinElmer, #NEL104001EA) и визуализированными с использованием камеры LAS500 CCD (GE Healthcare).

Для иммунофлуоресценции клетки высевали на покровные стекла, фиксировали в течение 15 минут в 4% параформальдегиде/фосфатно-солевом буфере (PBS) и хранили при 4°C до использования. Пермеабилизация достигалась с использованием 0,2% Triton/PBS с последующей 1-часовой блокировкой (5% обезжиренного молока, 10% FBS, 0,1% Triton и 0,5% BSA в PBS). Первичные антитела инкубировали в течение ночи при 4°C. Для иммунофлуоресценции использовали следующие антитела: поликлональные α-TOM20 (11802-1-AP; 1:1000) и α-VPS26A (12804-1-AP; 1:1000) от Proteintech; моноклональные α-dsDNA (ab27156; 1:1000), α-PDHX (ab110333; 1:500), α-ATP5A (ab14748; 1:500) и поликлональные α-RAB5 (1:500) из Abcam; поликлональные α-LAMP1 (#9091; 1:500), α-V5 (#13202; 1:500) и моноклональные α-V5 (#80076; 1:500) из Cell Signaling; моноклональные α-VPS35 (sc-374372; 1:500) из Santa Cruz. После промывания покровных стекол PBS образцы инкубировали с соответствующими вторичными антителами (1:1000, 1 час при комнатной температуре) от Thermo Fisher Scientific: козьи α-кроличьи в сочетании с Alexa-405 (#A-31556), козьи α-кроличьи Alexa-488 (#A-11008), козьи α-мышиные Alexa-488 (#A-11001), козьи α-кроличьи Alexa-546 (#A-11035), козьи α-мышиные Alexa-546 (#A-11030), козьи α-кроличьи Alexa-647 (#A-21245) и козьи α-мышиные Alexa-647 (#A-21235). Покровные стекла монтировали с помощью Fluoromount, содержащего 4′,6-диамидино-2-фенилиндол. (DAPI) (Thermo Fisher Scientific, #00-4959-52).

Конфокальная микроскопия и проточная цитометрия Для конфокальной микроскопии изображения были получены с помощью микроскопа Leica SP8 с объективом oil PL Apo 63x/1.40 и конфокального микроскопа PerkinElmer Spinning-disk UltraVIEW VoX с объективом 60x. Все изображения были деконволюцированы с помощью ImageJ (NIH) перед анализом для повышения разрешения. Яркость была отрегулирована одинаково по всему изображению. Все анализы изображений были выполнены с помощью ImageJ (NIH). Количественная оценка митохондриальной морфологии была достигнута с помощью инструмента анализа частиц с критериями неисключения. Количественная оценка митохондриальных везикул была выполнена с помощью внутреннего плагина IMAGE J путем подсчета частиц TOM20−/PDH+ или TOM20−/dsDNA+. Коэффициент корреляции Мандерса был рассчитан с помощью плагина JACOP. Профиль флуоресценции был получен путем рисования линии, покрывающей 50 пикселей, и использования плагина RGB Profiler.

Для экспериментов с LysoTracker клетки высевали на μ-Dish 35 мм, с высоким стеклянным дном (Ibidi, #81158) и трансфицировали плазмидой TWNKK319E-mCherry. Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки загружали 50 нМ LysoTracker Green (Thermo Fisher Scientific, #L7526) на 30 мин, после смены среды и немедленно визуализировали с помощью вращающегося диска при 37°C. Для анализа рассматривались только клетки, трансфицированные TWNKK319E-mCherry.

Анализ объемной митофагии проводили в клетках, стабильно экспрессирующих репортер митофагии Mitokeima. Анализ проточной цитометрии проводили на CytoFLEX-S (V4-B2-YG4-R3), Beckman-Coulter (программное обеспечение для получения CytExpert V2.4.0.28). После установки клеточного гейта (FSC-A/SSC-A) для дискриминации дублетов использовались FSC-H и FSH-W. Сигналы от конструкции mt-Keima измерялись в каналах детектора Violet 610 (возбуждающий лазер 405 нм; полосовой фильтр 610/20) и ECD (возбуждающий лазер 561; полосовой фильтр 610/20).

Электронная микроскопия
Эпидермис личинок дрозофил L3 был изолирован и зафиксирован погружением в 2% формальдегида, 2% глутаральдегида и 3 мМ CaCl2 в 0,1 М буфере какодилата натрия в течение 48 часов. Образцы промывали 0,1 М буфером какодилата натрия и постфиксировали 2% OsO4 в 0,1 М буфере какодилата, промывали 3 раза по 5 минут ddH2O, затем дегидратировали в восходящей серии этанола в течение 15 минут каждый (50, 70, 90 и 3 раза по 100%) при температуре 4°C. Образцы инкубировали в течение 15 минут с 50% этанолом/пропиленоксидом, затем дважды по 15 минут в чистом пропиленоксиде. Затем образцы были пропитаны смесью 50% Epon/пропиленоксида и 75% Epon/пропиленоксида в течение 2 часов каждой и чистым Epon в течение ночи при 4°C. На следующий день образцы были инкубированы со свежим Epon в течение 2 часов и помещены в плоские заливочные формы и отверждены при 60°C.

Ультратонкие срезы 70 нм были нарезаны с помощью ультрамикротома (Leica Microsystems, UC6) и алмазного ножа (Diatome, Биль, Швейцария) и окрашены 1,5% уранилацетатом и 3% раствором цитрата свинца Рейнольдса. Изображения были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM-2100 Plus (JEOL), работающего при 80 кВ, оснащенного камерой OneView 4K (Gatan).

Для CLEM клетки были высеяны на покрытые углеродом пластины, содержащие пронумерованную сетку. Клетки были трансфицированы плазмидами TWNKK319E-mCherry и VPS35-CFP, как описано ранее. Лизосомальная функция была заблокирована в течение 4 часов с помощью 10 мкМ хлорохина. За час до фиксации клетки были загружены 1x SYBRGold (Thermo Fisher Scientific, #S11494) и 250 нМ PK mito Deep Red (Spirochrome, #SC055). Клетки были зафиксированы в течение 30 минут при комнатной температуре и 30 минут при 4°C в 2% глутаральдегиде, 2,5% сахарозе и 100 мМ CaCl2 в 0,1 М Hepes (pH 7,4) и промыты 0,1 М буфером Hepes. Трансфицированные клетки, показывающие цитоплазматическую ДНК, сканировали с помощью конфокального микроскопа SP8 (Leica) с масляным объективом 63x/1.40, и использовали изображения в светлом поле для локализации координат интересующих клеток. После световой визуализации клетки инкубировали с 1% тетроксидом осмия в течение 30 мин при 4°C, промывали в 0,1 М какодилатном буфере и дегидратировали с использованием восходящей серии этанола (50, 70, 90 и 100%) при 4°C. Клетки инфильтровали смесью 50% Epon/этанола в течение 1 часа, 66% Epon/этанола в течение 2 часов и чистым Epon в течение ночи при 4°C. Капсулы TAAB, заполненные Epon, помещали вверх дном на стеклянное дно и отверждали в течение 48 часов при 60°C. Стеклянное дно удаляли, попеременно помещая чашку в кипящую воду и жидкий азот. Поверхность блока была обрезана по ранее отмеченным координатам с помощью инструмента для обрезки 90° (Diatome, Биль, Швейцария), и ультратонкие срезы 70 нм были нарезаны с помощью ультрамикротома (Leica Microsystems, UC6) и алмазного ножа (Diatome, Биль, Швейцария) и окрашены 1,5% уранилацетатом в течение 15 мин при 37°C и раствором цитрата свинца в течение 4 мин.

Для электронной томографии ультратонкие срезы 300 нм были нарезаны и инкубированы с 10 нм золотого протеина А (CMC, Утрехт), разбавленного 1:60 в ddH2O. Срезы были окрашены 2% уранилацетатом в течение 20 мин и раствором цитрата свинца Рейнольдса в течение 3 мин. Изображения для серии наклонов были получены с использованием последовательного ЭМ с размером пикселя 1,108 нм от −60° до 60° с шагом 1° на том же просвечивающем электронном микроскопе JEM-2100 Plus (JEOL), работающем при 200 кВ. Реконструкция была выполнена с использованием Imod, MiB и Imaris.

Проксимальное биотинилирование
Проксимальное биотинилирование проводили в трансдуцированных клетках, экспрессирующих конструкции Split Turbo ID RAB5C-Splint-V5 и SAMM50-SplitCt-HA. Клетки, экспрессирующие только SAMM50-Split, использовали в качестве отрицательного контроля.

Для выделения белка клетки HEK293 инкубировали в течение 4 часов с 250 мкМ биотина. Для индукции повреждения мтДНК клетки предварительно трансфицировали TWNKK319E-mCherry за 24 часа до инкубации с биотином. Осадки соскабливали с планшетов сразу после инкубации с биотином и солюбилизировали в буфере RIPA. Триста микрограммов общих белковых экстрактов очищали с использованием высокопроизводительных бусин Streptavidin Sepharose (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Для анализа вестерн-блоттинга бусины промывали три раза буфером RIPA, ресуспендировали в 2x буфере Лэммли, кипятили при 95°C в течение 5 минут и загружали в SDS-PAGE. Биотинилированные белки визуализировали с помощью антитела α-Streptavidin–HRP (Jackson ImmunoResearch, 1:2000, #016-030-084). Для масс-спектрометрии бусины промывали три раза буфером ABC [50 мМ бикарбонат аммония (pH 7,8)] и инкубировали в течение 10 минут с 50 мкл буфера мочевины (8 М мочевины), 1 часа с 5 мМ дитиотреитола и 30 минут с 40 мМ индол-3-уксусной кислоты при комнатной температуре и в темноте. Расщепление белка достигалось путем инкубации с Lys-C в соотношении 1:100 в течение 2–3 часов. Образцы разбавлялись буфером ABC до конечной концентрации мочевины 2 М и инкубировались с трипсином в течение ночи в соотношении 1:100. Расщепление останавливалось 1% муравьиной кислотой, а пептиды загружались в предварительно уравновешенные наконечники столика и хранились при температуре 4°C до использования для масс-спектрометрического анализа.

Анализ жидкостной хроматографией – масс-спектрометрией
Образцы протеомики, обогащенные аффинностью, анализировали в положительном режиме с использованием методов сбора, зависящих от требуемых данных, с помощью трибридной системы Easy-nLC 1000–Q Exactive Plus или Easy-nLC 1200–Orbitrap Eclipse (Thermo Fisher Scientific). Онлайн-хроматография была напрямую связана с системами масс-спектрометрии путем использования источника ионизации наноэлектроспреем. Пептиды разделяли с помощью обращенно-фазовой хроматографии с бинарной буферной системой буфера A (0,1% муравьиной кислоты в воде) и буфера B (0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле) с использованием 60-минутного хроматографического градиента. Разделение проводили на 50-сантиметровой насадочной аналитической колонке собственного производства, заполненной 1,9 мкМ шариками C18-AQ Reprosil Pur (Dr. Maisch). Используя 60-минутный хроматографический градиент, разделение пептидов на основе их гидрофобности проводили путем линейного увеличения количества буфера B от начальных 13 до 48% в течение 35 минут с последующим увеличением B до 95% в течение 10 минут. Колонку промывали в течение 5 мин, и начальные условия колонки достигались путем уравновешивания колонки в течение 10 мин при 7% B. Полные спектры масс-спектрометрии [отношение массы к заряду (m/z) от 300 до 1750] были получены с разрешением 70 000, максимальным временем инжекции 20 мс и целевым значением автоматического управления усилением (AGC) 3 × 106. Были выделены 10 наиболее распространенных пептидных ионов (окна изоляции 1,8 m/z) для последующей фрагментации HCD (NCE = 28), и тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) была записана с разрешением 35 000, максимальным временем инжекции 120 мс и целевым значением AGC 5 × 105. Пептидные ионы, выбранные для фрагментации, были динамически исключены в течение 20 с.

Обработка и анализ данных для протеомики
Все записанные файлы RAW были обработаны с помощью программного пакета MaxQuant 75 (1.5.3.8 для данных IP, 1.6.14 для pSILAC). Для идентификации и подсчета пептидов спектры MS/MS были сопоставлены с базой данных мышей UniProt (загруженной 15 августа 2019 г.) с использованием алгоритма поиска Andromeda 76. Для образцов с обогащением по аффинности множественность была установлена ​​на уровне одного, а трипсин/P был выбран в качестве пищеварительного фермента. Карбамидометилирование было установлено в качестве фиксированной модификации, а окисление метионина или N-концевое ацетилирование было выбрано в качестве переменной модификации. Пептиды были идентифицированы с минимальной длиной аминокислоты семь и пороговым значением ложного обнаружения (FDR) 1% на уровне пептидов. Белки были идентифицированы с FDR < 1% с использованием уникальных и лезвийных пептидов для количественной оценки. Квантификация без меток (LFQ) проводилась с использованием стандартных настроек алгоритма maxLFQ. Соответствие между запусками было активировано.

Статистический анализ и визуализация проводились с помощью программных пакетов Perseus (1.6.5) и InstantClue 77 и 78. Интенсивности LFQ образцов иммунопреципитации были преобразованы в log2 и отфильтрованы для белков, идентифицированных по крайней мере в двух повторах одного состояния. Отсутствующие значения были вменены с помощью плагина Perseus ImputeLCMD с использованием детерминированного подхода минимального значения (MinDet, значение q = 0,001) для моделирования нижних пределов обнаружения масс-спектрометра. Чтобы оценить основные компоненты, ответственные за дисперсии между образцами, авторы провели анализ основных компонентов. Кроме того, они провели двусторонний t-тест Стьюдента для выявления значительно регулируемых белков (S0 = 0,1, FDR на основе перестановки = 0,05, 500 рандомизаций). Если не указано иное, значительно обогащенные белки определялись путем объединения значений P с поправкой на FDR и log2 белковых FC (значение q < 0,05 и абсолютный log2 FC > 1). Анализ путей проводился с использованием Metascape (62).

Транскриптомный анализ
Для секвенирования РНК следующего поколения сначала был выделен и объединен эпидермис личинки L3 из пяти личинок. Общая РНК была извлечена, как объяснялось ранее, и 2 мкг РНК было секвенировано с использованием селекции Poly A +. Всего было получено от 25 миллионов до 30 миллионов прочтений на образец с использованием длины прочтения парных концов 100 пар оснований (Illumina NovaSeq 6000). Анализ контроля качества необработанных данных РНК-секвенирования был выполнен с помощью программного обеспечения FastQC v0.12.0 (Babraham Bioinformatics) и MultiQC v1.18. 3′ поли(A) хвостовик и 3′ адаптер от Illumina были обрезаны с помощью инструмента TrimGalore 0.06.10 (Babraham Bioinformatics) для достижения PhredScore выше 35 и содержания адаптера ниже 1%. Затем обрезанные считывания были сопоставлены с геномом Drosophila melanogaster (дрозофилы BDGPG.32, ENSEMBL) с использованием RNA-seq aligner STAR 2.7.10b, после чего была проведена оценка качества выравнивания с помощью Qualimap v2.2.1. Для оценки уровней экспрессии генов сопоставленные считывания для всех вариантов транскриптов гена (данные о количестве генов) были подсчитаны с помощью программного обеспечения RSEM v1.3.3.
Этапы контроля качества, обрезки, картирования и подсчета были выполнены в операционной системе Ubuntu 22.04.2 LTS. Дальнейший анализ был выполнен с помощью программного обеспечения RStudio 2023.03.0 +386 (R версии 4.2.2). Таким образом, количество генов было аннотировано с помощью пакета AnnotationHub Bioconductor, и были выполнены четыре анализа дифференциальной экспрессии, как с применением отрицательного биномиального распределения с пакетами EdgeR-LRT (тест отношения правдоподобия), EdgeR-QL (квазиправдоподобие) и DESeq2 bioconductor, так и с применением эмпирической модели Байеса с использованием анализа Лиммы-Вума. Гены с общей дифференциальной экспрессией среди четырех методов (cpm < 0,5; P < 0,05) были выбраны для GSEA с путями GO с помощью пакета clusterProfiler Bioconductor и базы знаний DAVID (NIH).

Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 10 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Значимость различий между двумя или более образцами рассчитывалась с использованием непарного и параметрического t-критерия Стьюдента или однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в соответствии с экспериментальным планом и распределением данных. Статистическая значимость определяется значениями P.