В предыдущей части мы разбирались со спецификациями в контексте профиля примесей. Настало время раскрыть вопрос природы процентов по пороговым значениям примесей, упоминаемых в СПЦ. То есть например примесь X не более 0.1% - что конкретно имеется ввиду?

Классический вопрос для ступора мозговины химика-разработчика - ”а у вас в отчете по профилю примесей проценты массовые или мольные?” Если бы автор за последние два года не встречался с этой проблемой, даже среди крайне опытных химиков из этих ваших биг фармов, то он не подумал бы писать этот текст.

Если покопаться в решении №138 (перевод ICH Q3A-D) то можно обнаружить следующую таблицу по пороговым значениям индивидуальной органической примеси:

Почему пороговые значения примесей имеют такие значения и их суть мы рассмотрим потом, пока важнее разобраться с темой поста.

Не будем тянуть с развязкой до последнего, как это любят делать в современных соц. сетях, да и ответ очевиден из таблицы выше:

Проценты по пороговым значениям примесей любого рода: органические, элементные примеси и растворители в спецификациях по умолчанию приводятся в массовом соотношении к основному активному веществу (АФС). То есть 0.1% = 1000 ppm = 1 мг примеси в 1 г АФС или масс/масс (% w/w). Ни в коем случае объем/объем (v/v) или моль/моль.

И дополнительный не менее важный пункт

Пороговые значения приводятся в отношении к АФС. Не к общей сумме примесей. То есть если у нас контроль двух отдельных примесей (A и B). То каждый раз необходимо производить отдельный расчет: примесь А к АФС и примесь В к АФС независимо друг от друга.

Это настолько очевидный вопрос, что в большинстве фармакопей, рекомендациях, он даже отдельно не расписывается, но для сомневающихся (и правильно делающих) можно привести ссылочку на австралийскую фармакопею:

Вопрос закрыт, можно расходится. Дальше будем душнить на тему небольших нюансов, связанных с интерпретацией данных во время разработки ЛС.

Суть проблемы

В целом казалось бы чего тут такого, массовая концентрация значит массовая концентрация, но можно пробежаться по этапам классического химического эксперимента:

1. После обзора литературы, формирования гипотез и анализа рисков по процессу, химик-органик ставит ряд реакций с целью доказать/опровергнуть гипотезу о влиянии различных факторов на профиль примесей.
2. По ходу протекания реакции или после выделения продукта, обычно это порошок или богомерзкая смола (второе чаще всего), появляется необходимость проанализировать реакцию/продукт, чтобы была возможность сделать какое-то заключение.
3. Для анализа, если игнорировать откровенно устаревший подход с тонкослойной хроматографией (ТСХ, TLC), в ход идут такие методы как, ВЭЖХ (HPLC/UPLC) и ГХ (GC). Остальные методы опустим как несколько экзотичные или отвечающие на вопросы идентификации, а не концентрации.
4. По ходу интерпретации аналитических данных химик-синтетик и делает выводы о целевой конверсии, полноте протекания реакции, профиля примесей и именно тут возникает проблема.

Для заключения выводов о уровне примесей, без надлежащего присмотра аналитиков, органики обожают интегрировать пик активного вещества и все что вообще вылезло чужеродного на хроматограмме. Иначе говоря используют метод внутренней нормализации.

Открывать ссылки времени нет, поэтому для понимания метода внутренней нормализации можно сослаться на условную хроматограмму выше как пример - для отчета о содержании уровня примеси B в субстанции A, интегрируют пики A→D и находят содержание примеси B как отношение площади пика B к сумме всех остальных пиков:

Думаю часть проблемы уже очевидна:

1. Чтобы от эксперимента к эксперименту, можно было сравнивать уровень конкретной примеси в образце необходимо лучше вычислять относительное содержание конкретной примеси к АФС. То есть S(B)/S(A) достаточно и не стоит приплетать сюда весь забор неопознанной НЁХ, которая был обнаружена.
2. И неочевидное - проценты на хроматограммах не являются массовыми. Вот такой шьямалановский поворот. Взаимосвязь сигнала аналитического инструмента и реальных массовых процентов зависит от собственно самого метода и детектора, который используется для анализа.

Если с первым пунктом не всё так плохо, то на втором пункте как раз и сыпется неприлично значимая часть разработчиков технологического процесса. Поэтому стоит чуть раскрыть проблему подробнее.

К аналитикам вопросов нет, вы обычно молодцы.

Принцип работы хроматографа

Чтобы ответить на вопрос выше, касаемо расчета концентраций, придется залезть в аппаратную часть вопроса, не всегда ответы лежат на поверхности.

Вспомним устройство самых популярных приборов используемых для анализа всего и вся: жидкостные и газовые хроматографы.

Думаю, что вы и так в курсе, но повторим и опишем принцип действия хроматографа в трех предложениях:

• Через стационарную фазу, сорбент, которая находится в колонке (Column) насосом прокачивается раствор мобильной фазы (solvent). При инъекции, растворенный образец уносится в Вальхаллу колонку вместе с мобильной фазой. Если хроматограф газовый, то мобильной фазой является газ. Кто бы мог подумать.
• В самой колонке, за счет различной степени любви конкретной молекулы к стационарной фазе, смесь веществ, находящаяся в образце, разделяется на составные части, таким образом мы и получаем разделение веществ. Как на вечеринке, люди уходят с неё пораньше или попозже, в зависимости от того нравится она им или нет.
• Весь этот компот поэтапно изгоняется в отход, предварительно проходя через детектор, который и измеряет концентрацию. В результате получается “забор пиков”, который характеризует качество образца.

Именно детектор нас сейчас и интересует, это такая волшебная коробка, которая “видит” вещества, которые проносятся сквозь неё, собирает сигнал, преобразует его и отправляет в ЭВМ, где уже происходит вторичное преобразование и отрисовка возможно красивых графиков, с помощью суровых математических методов.

От категории и принципа действия детектора и зависит степень отклика вещества, иначе говоря насколько интенсивным будет сигнал в зависимости от молекулярной структуры аналита (analyte). Некоторые из детекторов не видят вещества без хромофорных структур, а другие шкалят при виде сколь-либо приличных концентраций.

Типы детекторов

У нас нет цели запутаться во всем разнообразии детекторов, которое придумало человечество за свой недолгий технологический век, поэтому приведем только самые основные, самые используемые в индустрии в зависимости от типа анализа ВЭЖХ или ГХ.

Высоко Эффективная Жидкостная Хроматография (У/ВЭЖХ, HPLC/UPLC)

• UV или PDA (photodiode array) - самые популярные детекторы, рабочие лошадки индустрии. UV отличается от PDA тем что первый позволяет регистрировать сигнал только с определенной длиной волны (220 или 254 нм), тогда как второй снимает весь УФ спектр сразу (190-800 нм). Самый главный минус - вещество можно детектировать только при наличии хромофора в молекуле.
• Mass Spectrometry Detector - очевидно более дорогостоящий вариант, который применим не только к ВЭЖХ, но и к ГХ. Позволяет измерять молекулярную массу заряженных частиц (m/z). Несмотря на популярность у химиков-органиков в области качественного анализа, также используется для количественного анализа для очень низких концентраций (ng/ml), что крайне полезно для анализа генотоксичных примесей.
• Charged Aerosol Detectors (CAD) - мажористая и более дорогая версия ELSD (Evaporative Light Scattering Detector). Принцип работы похож, но CAD более чувствителен. Универсальны тем, что им плевать на структуру молекулы и наличие хромофоров - видят всё.

Газовая Хроматография (ГХ, GC)

• Flame Ionization Detector (FID) - классическая классика. Сжигает всё что попадает в него, генерируя заряженные частицы, после чего чувствительный элемент измеряет их концентрацию через сумму зарядов.
• Electron Capture Detector (ECD) - вариант для очень низких концентраций уровня пикограмм и более чувствителен ко всему, что не углерод.

Возможный зоопарк детекторов на самом деле насчитывает как минимум дюжину вариантов. Область и цель применения зависят от: природы препарата, цели анализа и ожидаемой концентрации аналита в растворе. Однако, львиную долю в фармацевтической индустрии составляют именно UV для ВЭЖХ и FID для ГХ.

Именно от типа детектора и зависит уровень аналитического сигнала, который поступает в ЭВМ для дальнейшей обработки.

Нюансы генерации сигнала нас и интересуют.

Ultraviolet Detector (UV-Vis)

Чтобы понять принципиальный вопрос работы детектора - проще всего рассмотреть до скуки банальный и простой УФ детектор, потому что все негуманитарии хоть раз в жизни работали с УФ-спектрофотометром в рамках очередной лабораторной работы.

Свет определенной длины волны (чаще всего 220 или 254 нм) проходит через раствор образца. Два фотодетектора замеряют свет до/после, чтобы вычислить финальное поглощение света. Итоговую концентрацию раствора вычисляют по той самой банальной формуле Ламберта-Бера:

где A - поглощение или искомый результат, ε - коэффициент экстинкции, с - концентрация (моль/л) , l - длина пути, который должен пройти свет или просто размер ячейки

И для чего мы залезли так глубоко - коэффициент экстинкции. Это коэффициент молярного поглощения, который зависит от самой молекулы и длины волны. Несмотря на достаточно успешные попытки предсказания этого коэффициента для некоторых молекул, его всё таки необходимо измерять экспериментально для каждого вещества отдельно.

Получается что чисто технически УФ детектор измеряет не массовую, а мольную концентрацию вещества в растворе, что уже наталкивает на размышления. Мы же только что договорились, что ищем массовые концентрации, а тут такое предательство.

Причем результат или сила отклика, в случае УФ детектора, зависит от длины волны света и структуры молекулы, а мы знаем, что примеси по структуре могут сильно отличаться от самой АФС, а значит и коэффициенты экстинкции не будут эквивалентны от вещества к веществу.

Хромофоры

В случае с фотометрическими методами, когда у нас задействован свет определенной длины волны, на коэффициент экстинкции влияет наличие хромофорных групп в молекуле.

Хромофоры это различные сопряженные системы в молекуле: алкены, диены, кетоны, ароматические системы (арены). Также нельзя не упомянуть про ауксохромы (auxochromes), которые интенсифицируют сигнал хромофоров, в целях краткости и так некраткого текста, тут просто будет оставлена ссылка, если интересны детали.

И уже было упомянуто, что сила поглощения зависит от длины волны, то есть вещества с большим количеством сопряженных систем будут интенсивнее поглощать свет на малых длинах волн, чем молекулы лишь с одной завалявшейся двойной связью. Определение наиболее оптимальной длины волны тоже важная часть аналитической разработки. Но если сил и ресурсов на собственную разработку нет, то иногда УФ спектры можно даже найти в NIST базе.

Оптимальная длина волны это что-то среднее позволяющее фиксировать значимый аналитический сигнал для всех интересующих веществ в растворе сразу. Конечно мир не рухнет, если выбрать в итоге не самую оптимальную длину волны, но не рекомендуется сравнивать результаты лоб в лоб для двух разных хроматограмм с разными длинами волн.

Физика процесса конечно, чуть более сложна чем “вещество поглощает свет” и представляет собой π → π* и другие переходы электронов между энергетическими уровнями. Но эти детали оставим квантовой химии.

Всё это безобразие с хромофорами и коэффициентами экстинкции как-то надо учитывать и вводить поправки в расчёты.

Relative Response Factor (поправочный коэффициент)

Напоминаю, с помощью ВЭЖХ мы контролируем профиль органических примесей в АФС. Каждая примесь имеет немного другую молекулярную структуру, следовательно из всего вышенаписанного, получается что 1 моль АФС, может давать совершенно разный уровень отклика - несоразмерный 1 моль примеси.

При этом всём нас интересуют массовые концентрации (мг/мл), а не мольные (моль/мл), поэтому для корректного расчёта концентраций примеси вводят поправочные коэффициенты или Relative Response Factor (RRF).

По формуле очевидно, что для корректного расчета RRF нам нужны предварительно выделенные стандартные образцы примеси и АФС. Поэтому идентификация и выделение примесей, или их закупка, обязательная задача в разработке процессов.

Если образца примеси нет. До валидации можно считать, что уровень отклика эквивалентен главному аналиту (АФС), но дальше все равно понадобятся доказательства.

На практике - при наличии доступа к ВЭЖХ-МС, можно установить гипотетическую структуру примеси заранее и прикинуть, будет ли она вести себя отлично от основного вещества, опять же это всё до момента финальной валидации.

Финальный расчет RRF коэффициентов является частью аналитической разработки и учитывает разницу в аналитическом отклике с поправкой на массовую концентрацию примеси, а не мольную.

Говоря про воспроизведенные препараты (дженерики) пункт в поправочными коэффициентами можно встретить в тех самых монографиях о которых было упомянуто уже раньше.

Поэтому можно привести характерный пример для простоты.

Пример

Как это всё выглядит на практике. Рассмотрим примеси субстанции Амлодипина безилат. В фармакопейной монографии упоминаются поправочные коэффициенты на две примеси - D и F c RRF 1.7 и 0.7 соответственно. Это конечно при упомянутой длине волны 257 нм, если её срукожопить поменять, то RRF также изменится и потребуется пересчет.

То есть примесь D поглощает свет сильнее чем сама субстанция в 1.7 раз из-за наличия целой ароматической системы пиридина вместо дигидропиридина. Следовательно, при условии одинаковых значений площадей пиков амлодипина и примеси D, это будет означать, что реальная концентрация примеси D в 1.7 раз больше.

if A(amlodipine) == A(impurity D):
    C(impurity D, mg/ml) = 1.7 x C(amlodipine, mg/ml)

И если не учитывать RRF, то можно сделать ложный вывод о том, что концентрация примеси не такая уж большая. После интеграции пиков кажется что уровень примеси всего 0.1%, а на самом деле он 0.17%, а значит он уже выше порога квалификации - незадача.

И обратная ситуация с примесью F. У нее RRF=0.7, значит она поглощает света в в 0.7 раз меньше основной субстанции. В данном случае можно переоценить концентрацию примеси в финальном продукте.

1. RRF измеряется относительно главного аналита - молекулы АФС. Если примесь новая или продукт инновационный, то RRF надо рассчитывать самому.
2. RRF > 1.2 - примеси больше чем кажется на самом деле. Риски ложнонегативных результатов
3. RRF< 0.8 - количество примеси меньше изначальной оценки. Риски ложноположительных результатов
4. RRF ∈ [0.8, 1.2] - по текущим гайдлайнам можно проигнорировать некоторую разницу, однако если уж RRF был посчитан, почему бы не применить. Систематическая погрешность в 20% для примесей малых молекул считается терпимым уровнем ввиду особенностей метода.

‼️Конкретные значения вышеприведенных RRF даны только в контексте малых молекул для наглядности. В случае пептидов, олигонуклеотидов и других высокомолекулярных молекул допустимые границы RRF отличаются. Об этом в следующей части про пороги информирования

RRF и другие детекторы

Вернемся к детекторам. С УФ вроде всё понятно - коэффициент экстинкции, зависит от молекулярной структуры и влияет на RRF. Однако относительный уровень отклика зависит от принципа работы детектора. А значит значения RRF применимы только к конкретной паре веществ, в определенном типе анализа и условиях хроматографирования.

Например, возьмем самый популярных для ГХ Flame Ionization Detector (FID) - деструктивный тип детектора, то есть вещество не выживает при анализе и сгорает в токе водорода. Ионизированные частицы регистрируются детектором, давая аналитический отклик.

В случае с FID величина сигнала зависит также от молекулярной структуры, но хромофоры роли не играют, они уже почили в огне🔥. Величина сигнала зависит от количества атомов углерода и их степени окисления. А значит предсказать конкретный RRF уже даже приблизительно сложновато, только эксперименты. Ну да есть формулы, но это крайне скользкая дорожка.

Как уже был упомянуто пару разделов выше, для перечисления количества возможных детекторов не хватит всех отростков на теле, и в каждом из детекторов уровень аналитического отклика зависит от его принципа действия и молекулярной структуры аналита.

Поэтому сравнивать просто площади пиков веществ между собой и делать какие-то финальные выводы без калибровки на реальные концентрации - как минимум опрометчиво. Как максимум, откровенно тупо, уже понятно по какой причине.

Итого

С главным вопросом мы разобрались - когда в спецификациях выплывают проценты, то речь идет о массовых долях в АФС. Однако во время непосредственного анализа проценты могут быть вполне себе мольными и требуется пересчет на массу с учетом имеющихся стандартов и знаний о молекулярной структуре примеси.

Вспоминая неидеальный цикл Деминга - результаты анализа это неотъемлемая часть эксперимента и от их качества зависят финальные результаты. Под качеством подразумевается и умение правильно интерпретировать данные на руках.

Поэтому прежде чем радостно интегрировать на хроматограмме всё подряд стоит не забывать о нюансах:

1. Метод внутренней нормализации не карается смертной казнью, но для финальных отчетов о чистоте субстанции в разрезе индивидуальных примесей всё таки не совсем подходит, даже для ранних этапов разработки.
2. Для отчета уровня индивидуальной примеси лучше конечно придерживаться фармакопейных методов и учитывать только примесь и главную молекулу (АФС) в расчетах. Во время разработки процесса, внешнего стандарта конечно под рукой не будет, но можно допустить главную молекулу как внутренний стандарт. Если в команде добрые аналитики и есть доступ к прибору, то можно самому сбацать калибровочные кривые относительно условного ионола. Заодно поможет с расчетом выходов в растворе.
3. Природу используемого детектора - как он может исказить уровень аналитического отклика и всё догадки по RF не будут релевантные.
4. Имеются ли RRF хотя бы из литературы, если их нет, то не забывать про гипотетические молекулярные структуры примесей и прикидывать возможную разницу в откликах.

Если держать все вышеперечисленные пункты в уме, то можно уже на этапе ранней разработки обозначить какие примеси правда являются критическими показателями качества (CQA), а какие в принципе не представляют угрозы.

И финальные цифры по содержанию той или иной примеси важны в разрезе наличия порогов информирования, идентификации и квалификации о которых дальше и поговорим.

3. Пределы содержания примесей в ЛС

Откуда берутся допустимые нормы понятно, как их правильно измерять вроде тоже уже разобрались, пора разобраться сколько конкретно примесей может вполне легально содержаться в наших ЛС.