«Дикий тип»: реальная применимость домашних штаммов при микробиологическом тестировании
Walk on the wild side: The application of environmental isolates in microbiological testing BY DR TIM SANDLE | EJPPS | 14 March 2022
Переведено с Английского языка – Барчева Ангелина
В течение последнего десятилетия наблюдалась тенденция к использованию домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды в качестве тест организмов при проведении тестирований в фармацевтических микробиологических лабораториях. Примерами подобных практик являются аттестация микробиологических методов (таких как проверка пригодности метода (АМД – примечание переводчика)), тест на ростовые свойства питательных сред, а также оценка эффективности дезинфицирующих средств ¹. Основная движущая сила, стимулирующая использования домашних штаммов (локальных изолятов), исходила от регулирующих органов (не существует иной литературы, описывающей подобное применение). По словам представителя FDA, последние ожидания регулирующих органов в отношении использования домашних штаммов (локальных изолятов) из производственной среды для проверки качества питательных сред подтверждаются многочисленными замечаниями, выписанными U.S. FDA² в последние годы. Использование домашних штаммов (локальных изолятов) также соотносится с представлениями многих микробиологов о том, что им необходимо расширять панель тест микроорганизмов, чтобы доказать надежность, робастность и воспроизводимость применяемых микробиологических методик.
Однако, учитывая, что для этих целей легко подходят типовые штаммы микроорганизмов из утвержденных коллекций, считается необходимым задуматься о достаточности аргументации для внедрения домашних штаммов производственной среды в рутинную практику.
Происходящие в популяции микроорганизмов фенотипические вариации - не оспоримый факт, и он дает эволюционное преимущество, от адаптации к новым условиям до персистирующих субпопуляций, выживающих при губительных воздействиях противомикробных препаратов или дезинфицирующих средств. Основным аргументом в пользу использования домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды является предположение, что такие штаммы (изоляты) будут демонстрировать иные характеристики микробного роста и, таким образом, в некотором роде будут «более выносливыми», чем лабораторные штаммы, полученные из коллекционных культур. Бактерии, подвергнутые воздействию изменчивой производственной среды, станут демонстрировать большую адаптивность к новым условиям ³. В свою очередь, это основано на представлении, что производственные штаммы обладают характеристиками «дикого типа», которые сохраняются в течение определенного периода времени или в течение установленного количества пассажей.
Под «диким типом» подразумевается, что либо произошел отбор (выживание более приспособленных представителей микроорганизма), либо изолированные микроорганизмы проявляют отличные фенотипические характеристики – специфические признаки (на уровне вариаций между отдельными клетками), которые видимы микробиологу и не всегда отражаются в микробном геноме.
Более того, два различных вида микроорганизма никогда не будут адаптироваться одинаково в одних и тех же стрессовых условиях (существуют различия в фенотипической пластичности), и в пределах одного вида субпопуляции будут вести себя по-разному ⁴. Не существует единого мнения о том, какие фенотипические характеристики важны, они будут различаться в зависимости от типов воздействий, которым подвергался микроорганизм. Среди адаптивных черт возможны: изменение размера клеток ⁵; потребность в различных или измененных уровнях питательных веществ (диауксический сдвиг) ⁶; различия между подвижными и неподвижными клетками ⁷. Самой интересной адаптивной характеристикой является скорость роста, учитывая подчеркнутое сосредоточение фармакопеи на «времени инкубации» как части критериев приемлемости для микробиологических методов.
Второй спорный в среде микробиологов вопрос, заключается в том, продолжают ли возникшие однажды фенотипические изменения (характеристики «дикого типа») присутствовать после того, как организм был пересеян на богатые питательными веществами лабораторные среды, или же организм становится фенотипически гетерогенным, демонстрируя характеристики в зависимости от типа питательных сред ⁸. Кроме того, если эти особенные характеристики «дикого типа» сохраняются, то как долго или через сколько этапов пересевания они остаются достаточно значимыми, чтобы влиять на рост колоний.
Набор тест микроорганизмов, рекомендуемых фармакопеями, национальными и международными стандартами существует для обеспечения воспроизводимости между лабораториями при проведении одних и тех же микробиологических методик анализа. В случае большинства стандартов они разработаны для многоцелевого применения, а иногда и для многоотраслевого применения. Однако набор указанных тест штаммов может подходить или не подходить для каждого конкретного метода или производства, так как списки не менялись последние десятилетия. Стабильность в этой части регуляторики легко обьясняется усиленным развитием современных знаний о микробных рисках, за которыми фармакопея или стандарт CEN или ISO не успевают. Одной из важных задач микробиолога на фармацевтическом предприятии является рассмотрение списка тест штаммов и решение о необходимости его дополнения. Например, существуют веские аргументы в пользу включения Micrococcus luteus в список микробиологических тест штаммов для оценки сред, используемых для мониторинга производственной среды, учитывая общую связь этой бактерии с микробиомом внешних слоев кожи человека ⁹, а также тот факт, что на Micrococcaceae приходится значительная доля организмов, выделяемых из чистых помещений ¹⁰. Повсеместность распространения микроорганизма само по себе не обязательно является критерием для включения его в список тест штаммов. Скептики могут возразить, что вид Staphylococcus уже рекомендован фармакопеей в качестве тест штамма, и на этом основании есть ли смысл включать другой кокковый микроорганизм, выделенный из чистого помещения? Однако за пределами вида разные семейства предъявляют разные требования, а виды Micrococcus обладают способностью выживать в течение длительных периодов времени в чистых помещениях. Как заметил Бэйрд-Паркер еще в 1963 году, микрококки являются сапрофитами, которые менее требовательны к питанию и более изменчивы морфологически и биохимически, чем стафилококки ¹² (на основании трудов Бэйрд-Паркера микрококки были выделены в самостоятельный от стафилококков род – примечание переводчика).
Расширения списка тест штаммов имеет смысл с точки зрения улучшения репрезентативности, должно ли это расширение идти за счет домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды? Аргумент, используемый сторонниками этой идеи, связан с ожиданием, что домашние штаммы, изолированные из определенной экологической ниши, покажут иные характеристики роста, скорости роста, культуральные свойства, по сравнению с штаммами поддерживаемыми на лабораторных питательных средах. Чтобы рассмотреть этот вопрос детальнее, нам нужно рассмотреть культивируемость и экологические стресс факторы.
Термин «жизнеспособный, но некультивируемый» хорошо известен ¹³ ¹⁴ в среде микробиологов. То, что в окружающей среде существуют микроорганизмы, которые нельзя выращивать на питательных средах, известно благодаря применению молекулярно генетических методов. Такие методы предоставляют информацию о генетическом разнообразии микроорганизмов ¹⁵ и предполагают, что в мире больше тех, кто не поддается культивированию, чем микроорганизмов, способных расти на питательных средах в лаборатории¹⁶ ¹⁷. Это, кстати, свидетельствует о том, почему в чистых помещениях поддержание контролируемого состояния производственной среды всегда будет важнее, чем простое проведение производственного мониторинга. Ситуации, когда организмы сохраняют свою жизнеспособность, но не могут расти на лабораторных средах, могут быть вызваны тремя причинами. Во-первых, еще не была (или не может быть) разработана питательная среда, позволяющая их культивировать ¹⁸. Во-вторых, микроорганизмы могут быть культивируемыми, но используемая питательная среда или выбранные параметры инкубации не способствуют их росту ¹⁹.
В-третьих, организмы могут быть культивируемыми при наборе условий, но из-за активности некоторого «стресс фактора», их рост невозможен или замедлен. Стресс факторы могут включать: условия окружающей среды, такие как экстремальные температуры, голодание/недостаток питательных веществ, изменения pH, осмотический стресс, активные формы кислорода, воздействие консервантов, дезинфицирующих средств или радиации. Многие из перечисленных стресс факторов особенно типичны для чистых помещений. Реакция на стресс факторы может вызвать образование спор у некоторых ²⁰ и стратегию низкого потребления энергии или покоя у других, когда клетки остаются метаболически активными, но не делятся ²¹⁻²³. В других случаях рост может происходить, но требуется длительное время из-за фенотипических изменений. Это может проводить к изменению размера клеток ²⁴.
Присутствие стресс факторов, это обычное явление для таких фармацевтические обьектов контроля, как системы водоснабжения и чистые помещения. Микроорганизмы, сталкивающиеся с неоптимальными условиями, будут адаптироваться и перераспределять энергию для поддержания гомеостаза при дефиците ресурсов ²⁵. Некоторые таксоны обладают гибкостью для образования АТФ с использованием различных комбинаций акцепторов и доноров электронов, тогда как другие организмы специализируются на усвоении уникальных субстратов или сохранении энергии путем приостановки своей метаболической активности ²⁶ ²⁷. Другие бактерии, такие как как сапрофитные, могут питаться мертвыми клетками для удовлетворения своих метаболических потребностей и поддержки ограниченного клеточного деления (так называемая «рециркуляция некромассы») ²⁸ ²⁹.
Все эти факторы безусловно оказывают влияние на разнообразие небольших популяций микроорганизмов ³⁰. Такие условия также могут привести к ускорению популяционных мутаций ³¹ ³², причем более длительное голодание приводит к наибольшему числу генетических и фенотипических изменений ³³, а также к появлению большего количества штаммов, несущих мутации, которые увеличивают или уменьшают частоту персистеров (спящих клеток) ³⁴.
Анализ производственных изолятов
Установлено, что организмы будут проявлять фенотипические вариации в различных условиях окружающей среды. Сторонники включения домашних штаммов производственной среды в микробиологические испытания утверждают, что специфические реакции на стресс и механизмы выживания, приводят к различным паттернам роста ³⁵ ³⁶.В условиях стресса некоторые микроорганизмы могут показывать устойчивое отсутствие роста, вызванное недостаточной продолжительностью инкубации.³⁷Подобные адаптации становятся весовым аргументом в пользу включения домашних штаммов (локальных изолятов) в стандартные протоколы исследований и, на основе накопленных данных, увеличения времени инкубации для получения достаточного визуального роста на чашке ³⁸. Время играет большое значение, не только от момента начала инкубации, но и времени анализа/отбора, когда происходит перенос микроорганизма из места обитания на питательную среду, поскольку существует момент, после которого воспроизводимость микроорганизма уже невозможно. Выживаемость специфична для каждого таксона ³⁹. Требуется ли более длительная инкубация для воспроизводимости производственных изолятов? В фармацевтических исследованиях найдется мало статей, изучающих рост и выделение домашних штаммов (локальных изолятов) производственной среды. Тем не менее, исследования изучали кривые выживаемости различных экологических ниш (мест обитания) и показатели воспроизводимости в условиях лаборатории⁴⁰. Например, исследование темпов роста изолятов Pseudomonas aeruginosa из различных экологических ниш (включая реки и частные дома) показало высокое различие темпов роста на питательных средах между выделенными изолятами ⁴¹. Следовательно, время, необходимое для инкубации, зависит от вида микроорганизма и его физиологического состояния. Однако такие выводы были отмечены не всеми исследователями, а другие исследования показали быструю адаптивность и быструю потерю любых характеристик дикого типа ⁴² ⁴³. Микроорганизмы по-разному реагируют на факторы окружающей среды, эти реакции оказывают влияние на метаболические процессы, и могут являться триггерами для вывода микроорганизма из состояния покоя.
Факторы перечисленные выше вынуждают задаться вопросами: «как долго следует инкубировать микроорганизмы на питательной среде?» и «требуют ли домашние штаммы (локальные изоляты) более длительного времени инкубации по сравнению с фармакопеей?» Если в ходе валидации можно показать, что скорости роста микроорганизмов схожи, то необходимость специально включать домашние штаммы (локальные изоляты) производственной среды теряет актуальность, но аргументы в пользу расширения списка тест штаммов остаются.
В то же время, если обнаружено что рост домашнего штамма требует более длительного времени инкубации, то необходимость его включения становится более чем актуальна. Если происходит подобное, то скорее всего, объясняется длительностью лаг фазы, происходящей до начала экспоненциального роста.
Также может быть, что конкретному микроорганизму необходима более длительная инкубация (по сравнению с описанной в фармакопеи) для обеспечения воспроизводимости. В качестве альтернативы может потребоваться введение этапа роста микроорганизма на обогащенной среде, но это усложняет работу с таким домашним штаммом.
Работу по домашним штаммам (локальным изолятам) производственной среды необходимо проводить на основании всесторонней оценки и исследований его роста, условий среды и оценки стресс факторов, такие работы индивидуальны для каждого производственного предприятия.
Эта статья была написана с целью стимулирования обсуждение данной темы. Цель состояла в том, чтобы взвесить аргументы за и против использования домашних штаммов (локальных изолятов) на фармацевтических предприятиях. Для освещения аргументации обеих сторон были приведены ссылки на соответствующую литературу.
Список тест штаммов, используемых в микробиологических лабораториях фармацевтических предприятий, должен быть более репрезентативным, дабы доказать робастность применяемых методик. Вопрос остается лишь в том, должен ли этот список быть расширен за счет домашних штаммов или штаммов из утвержденных коллекций культур микроорганизмов, и насколько вообще это имеет значение?