От хорька к куриному яйцу
Хорьки помогли доказать, что грипп вызывает вирус. Но на этом работа только начиналась.
Обнаружить возбудителя — ещё не значит научиться с ним работать. Вирус требовалось регулярно выращивать, получать в достаточном количестве, сравнивать разные штаммы, измерять их активность и наблюдать, как они меняются. Хорьки для постоянной лабораторной работы подходили не идеально. Они занимали много места, требовали ухода, дорого обходились и могли заразиться другими инфекциями. К тому же научный прогресс заметно замедляется, если каждый эксперимент приходится согласовывать с характером хорька)
Исследователям была нужна более простая, дешёвая и воспроизводимая биологическая система. И нашли её там, где человек, далёкий от вирусологии, вряд ли стал бы искать, — внутри оплодотворённого куриного яйца.
Да, следующим важным лабораторным помощником стало яйцо. Оно не чихало, не кусалось, не требовало отдельного вольера и в целом проявляло образцовую дисциплину. Правда, яйцо было не совсем обычным: оно было оплодотворено и несколько дней находилось в инкубаторе. Внутри уже развивался куриный эмбрион, окружённый живыми оболочками и заполненными жидкостью полостями. Для вирусолога это была не просто будущая курица, а небольшая автономная лаборатория.
Именно такое яйцо держит в руках Фрэнк Макфарлейн Бёрнет на портрете Уильяма Дарги.
Как Бёрнет пришёл к этому методу
Первые эксперименты с выращиванием вирусов животных в оплодотворённых яйцах Бёрнет проводил в 1932–1933 годах в Национальном институте медицинских исследований в Хэмпстеде, неподалёку от Лондона. Там же немного позднее прозвучала знаменитая фраза: «Хорьки чихают».
Бёрнет не изобрёл саму идею использования куриного эмбриона с нуля. Он опирался на метод американского патолога Эрнеста Гудпасчера, который вместе с коллегами выращивал вирус птичьей оспы и другие вирусы на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона.
Но Бёрнет увидел в этом подходе значительно больше, чем просто новый способ поддерживать вирус в лаборатории. Он начал приспосабливать яйцо для систематического исследования вирусных инфекций и совершенствовать саму технику заражения.
Сохранилась замечательная семейная история. Жена Бёрнета Линда рассказывала, что однажды он взял из домашней кладовой яйцо и одолжил у неё пилочку для ногтей, чтобы попытаться аккуратно вскрыть скорлупу и получить доступ к оболочке эмбриона. Когда маникюрного инструмента оказалось недостаточно, будущий нобелевский лауреат обратился за помощью к стоматологу, располагавшему бормашиной.
Так один из важнейших методов классической вирусологии начинался с яйца, пилочки для ногтей и стоматологического оборудования🙈Наука иногда требует дорогостоящей аппаратуры, а иногда — просто человека, готового посмотреть на содержимое семейной кладовой как на лабораторный ресурс.
Что находится внутри яйца
Чтобы понять действие Бёрнета на портрете, нужно представить внутреннее устройство оплодотворённого яйца. В нём находится не только эмбрион, но и целая система оболочек и полостей:
- амниотическая полость непосредственно окружает эмбрион;
- аллантоисная полость содержит жидкость, в которой некоторые вирусы могут накапливаться в больших количествах;
- желточный мешок обеспечивает питание;
- хориоаллантоисная оболочка, или ХАО, богата кровеносными сосудами и образована живыми клетками.
Разные вирусы предпочитают разные ткани. В этом отношении они оказались довольно капризными постояльцами: одному требовалась оболочка, другому — амниотическая полость, третьему — аллантоисная жидкость
Первоначально Бёрнет работал прежде всего с хориоаллантоисной оболочкой. Позднее для выделения и выращивания вируса гриппа стали особенно важны амниотическая и аллантоисная полости.
Как Бёрнет усовершенствовал метод
Вернувшись в 1934 году в мельбурнский Институт медицинских исследований Уолтера и Элизы Холл, Бёрнет продолжил эксперименты с куриными эмбрионами.
Он усовершенствовал способ работы с хориоаллантоисной оболочкой. В скорлупе делали отверстие, а саму оболочку осторожно «опускали», создавая между ней и скорлупой искусственное воздушное пространство. Через открытое «окно» на поверхность оболочки можно было нанести вирусный материал, после чего отверстие закрывали, а яйцо возвращали в инкубатор.
Вирус размножался в клетках оболочки и образовывал небольшие видимые поражения — беловатые участки инфицированной ткани, которые называли оспинами, очагами или бляшками. Каждый такой участок возникал в результате размножения вируса в группе соседних клеток.
Эти очаги можно было подсчитать. А значит, вирус впервые становился не просто невидимой причиной болезни, а объектом, активность которого можно было измерять количественно.
Если на оболочке появлялось много очагов, в образце содержалось больше активного вируса. Если после разведения материала их становилось меньше, можно было рассчитать примерную концентрацию инфекционных частиц. Этот процесс называли титрованием.
Метод был дешёвым, надёжным и сравнительно простым. Яйцам не требовался сложный уход, а один исследователь мог одновременно работать с большим количеством образцов.
Сам Бёрнет очень гордился своим умением обращаться с яйцами. В 1936 году британский Совет по медицинским исследованиям опубликовал его монографию The Use of the Developing Egg in Virus Research — «Использование развивающегося яйца в исследованиях вирусов». В следующем году в Journal of the American Medical Association предположили, что этот метод может приобрести «большое значение в будущем» для исследований, профилактики и лечения вирусных заболеваний.
Предсказание оказалось даже осторожнее действительности.
Что конкретно делает Бёрнет на портрете
На картине Бёрнет не просто задумчиво держит яйцо ради красивой композиции. Он выполняет определённую лабораторную процедуру — инокуляцию, то есть заражение оплодотворённого яйца исследуемым вирусным материалом.
Яйцо закреплено на небольшой подставке. В одной руке учёный держит его, а другой работает с тонкой стеклянной пипеткой или иглой. Вероятнее всего, он собирается ввести подготовленный образец через отверстие в скорлупе в заранее выбранную область яйца.
Перед процедурой яйца несколько дней выдерживали в инкубаторе при контролируемой температуре. Затем их просвечивали ярким светом — этот приём называется овоскопированием. Так определяли положение эмбриона, воздушной камеры и крупных кровеносных сосудов. Исследователю нужно было выбрать место прокола так, чтобы доставить материал в нужную полость и не повредить эмбрион.
На скорлупе отмечали точки для отверстий, поверхность очищали, после чего скорлупу осторожно прокалывали или просверливали. Затем внутрь вводили точно отмеренную дозу вирусного материала. Отверстие герметично закрывали, а яйцо возвращали в инкубатор.
В зависимости от цели исследования материал можно было нанести на хориоаллантоисную оболочку либо ввести в амниотическую или аллантоисную полость. После инкубации яйцо охлаждали, вскрывали и собирали содержащую вирус жидкость или изучали поражения оболочки.
На портрете невозможно с абсолютной уверенностью определить, в какую именно область яйца Бёрнет вводит материал. Однако описание самого Института Уолтера и Элизы Холл подтверждает: художник изобразил учёного именно в момент заражения яиц для вирусологических исследований.
Что находится на столе
Окружающие Бёрнета предметы — не декоративный лабораторный натюрморт.
Слева в зелёном сосуде стоят длинные стеклянные пипетки. С их помощью набирали, отмеряли и переносили небольшие объёмы жидкости. Автоматических микропипеток тогда ещё не существовало, поэтому точность работы во многом зависела от навыка исследователя.
Справа находится деревянный штатив с пробирками. В них могли находиться вирусные образцы, приготовленные разведения, стерильные растворы или материалы, полученные после вскрытия других яиц.
На столе лежат тонкие инструменты и резиновый шланг, а перед учёным видна лабораторная горелка. Открытое пламя использовали для стерилизации инструментов и создания более чистой рабочей зоны. Любая случайная бактериальная инфекция могла испортить яйцо и сделать результаты опыта бесполезными.
Бёрнету требовались точность и уверенность. Нужно было проколоть скорлупу, попасть в необходимую полость, не травмировать эмбрион, не занести посторонние микроорганизмы и ввести строго определённое количество материала. Выражение лица на портрете спокойное, но работа в его руках весьма тонкая.
Как яйцо стало системой для изучения гриппа
Для исследования гриппа особенно важными стали амниотическая и аллантоисная полости.
Амниотический путь был полезен при первичном выделении некоторых штаммов из материала, полученного от больных. Вирус вводили ближе к развивающемуся эмбриону, где имелись подходящие для его размножения клетки.
После адаптации штамма его часто выращивали в аллантоисной полости. Вирус размножался в клетках оболочки и в большом количестве накапливался в аллантоисной жидкости. Эту жидкость было сравнительно легко собрать и исследовать.
Важным событием стало открытие Джорджа Херста в 1941 году: оказалось, что вирус гриппа способен вызывать гемагглютинацию, то есть склеивание эритроцитов.
Если вирус присутствовал в образце, эритроциты образовывали характерную сетку. Если его не было, клетки оседали на дно плотной точкой. Такой тест позволял сравнительно быстро обнаруживать вирус и оценивать его количество, не дожидаясь развития очевидных симптомов у животного.
