Затирание. Осахаривающие ферменты
Много-много лет назад в один из пивных чатов прилетела ссылка на статью, посвящённую карапилсу и прочим декстриновым солодам. Ссылка эта была на сайт «Брюлософии», и это было моё первое знакомство с этим ресурсом. В статье недвусмысленно ставился вопрос целесообразности использования декстриновых солодов в пивоварении по прямому назначению, заявленному производителем, — улучшение пеностойкости и увеличение тела пива.
Ознакомившись с подходом ребят из «Брюлософии», я полностью пересмотрел свой подход к пивоварению: от кулинарного — к околонаучному. Сказать, что этот ресурс меня поглотил целиком и полностью, — ничего не сказать.
И вот примерно два года назад я написал разгромную статью, посвящённую декстриновым солодам. В ней я аккумулировал теорию, весь имеющийся в сети опыт, а также свой личный по этой теме.
Собственно, суть статьи заключалась в том, что карапилсы при задаче напрямую в затор практически полностью расщепляются до сбраживаемых сахаров и предельных декстринов, и толку от них никакого нет.
Сделал теоретические подводки, ссылки на Кунце, «Брюлософию» и других авторов. И всё бы ничего, да вот оставалась маленькая загвоздка. Сам дорогой и уважаемый товарищ Кунце в своём монументальном труде также пишет следующее:
«Солод Carapils® и Carafoam® очень светлый. Для достижения цветности 3,5–5,0 ед. EBC в обжарочном барабане проводят только осахаривание, а сушку до содержания влаги 6–7 % затем ведут в сушилке при температуре 60–65 °С. Термическая нагрузка на данный солод из-за непродолжительной фазы обжарки невелика. Применение до 15 % такого солода улучшает полноту вкуса пива и его пеностойкость. В лёгком и безалкогольном пиве доля солода такого типа может достигать 30 %.» [1, стр. 203]
Такое жирное противоречие я не мог проигнорировать, поэтому статью решил для начала отправить старшим товарищам на проверку.
И тут случилось страшное. Моя стройная теория была изнасилована так стремительно и так полно, что я не успел даже выкрикнуть стоп-слово.
Мне, конечно, за логику поставили отлично, а по предмету — неуд, и послали учить матчасть.
Если честно, я долго обтекал и не мог понять, в чём я неправ. Развёрнутых комментариев мне, к сожалению, не дали. И мне хотелось спорить, мне хотелось задать тысячу вопросов, но я не мог себе позволить окончательно потерять лицо. Я просто поблагодарил за аудит, собрал с пола остатки самолюбия и молча удалился в закат.
Открыв Кунце, я раз за разом перечитывал раздел «Затирание», но так и не мог понять, в чём была моя ошибка, а правильнее сказать — непонимание.
Стало очевидно, что Кунце эту тему не раскрывает, а чтобы копать глубже, нужно много времени, сил, а главное — интерес. И вот как раз-таки в этот момент я интерес потерял целиком и полностью. Отправил статью в дальний ящик и, можно сказать, про неё окончательно забыл.
И вот в ноябре прошлого года я обсуждал рецепт американского пейл-эля с одним практикующим крафтовиком, и он скинул мне вариант своей засыпи, в которой была такая позиция — 5 % Dextrin Malt.
Обозецьки, вы даже не представляете, как меня триггернуло в этот момент. Это был настоящий голливудский флешбэк: Вьетнам, вертолёты, запах напалма поутру.
Чтобы вы понимали, я всегда считал себя «экспертом» в области затирания и мог любому затереть про затирание. И мысль о том, что у меня есть большой пробел в понимании этого процесса, стала ментальным древоточцем моего мозга.
Несколько недель я посвятил глубокому погружению в ферментативный гидролиз, чтобы досконально разобраться в вопросе, и незаметно перешёл из стадии «Экспэрт» в стадию «Гуру». И вот когда я преисполнился знаниями, со мной произошла удивительная история, которая отодвинула тему с карапилсами на второй план.
И эту удивительную историю я вам сегодня расскажу.
Заодно разберём пару тонких моментов, зная которые можно нехило так повыёживаться в чатиках. Приятного чтения.
Глюкоза
Глюкоза — это моносахарид (альдогексоза), простой сахар с 6 атомами углерода.
Это один из главных источников энергии для живых клеток.
Не, ну вы только гляньте на эту гусеницу. Глюкоза реально мне напоминает гусеницу хотя бы тем, что она может находиться в растворе в двух состояниях — линейном и кольцевом. В большинстве случаев в растворе она хватает себя за жёпу и пребывает в циклической форме, нежели в линейной. Именно поэтому её обычно показывают кружочками или шариками.
Если внимательно посмотреть на линейную молекулу, то можно увидеть шесть атомов углерода, которые имеют свою нумерацию слева направо: первый атом углерода имеет номер 1, последний — номер 6.
Самое интересное здесь — край молекулы, начинающийся с C1. Это редуцирующий конец молекулы.
Что значит редуцирующий конец?
Это значит, что молекула этим концом может участвовать в окислительно-восстановительных реакциях.
Например, при изготовлении зеркал методом серебрения глюкоза восстанавливает Ag⁺ до Ag.
Собственно, глюкоза называется редуцирующей, потому что она может отдавать электроны другому веществу, а это другое вещество при этом восстанавливается. Сама глюкоза при этом, наоборот, окисляется и превращается в глюконовую кислоту. Собственно, реагирует глюкоза именно этим самым концом — с атомом C1.
На рисунке 2 вы видите кольцевую молекулу глюкозы и её условное обозначение, которое дальше мы будем использовать для объяснения процессов гидролиза крахмала. Конец C1 молекулы находится со стороны стрелки, а конец C4 — со стороны знака равенства. Конец C6 находится между знаком равенства и стрелкой.
Крахмал
Крахмал — это смесь двух основных полисахаридов: амилозы и амилопектина.
Амилоза
Амилоза — это самая простая форма крахмала: линейная цепочка, в которой молекулы глюкозы соединяются по принципу связи 1–4, то есть первым и четвёртым атомами углерода (α-1,4).
Молекула амилозы — это просто длинная «верёвка» из глюкозных остатков.
Амилопектин
Амилопектин можно представить как множество α-1,4-цепочек глюкозы, соединённых между собой α-1,6-разветвлениями.
Визуально молекула амилопектина напоминает ветвистую яблоню: множество веточек расходятся и разветвляются от основных линий. Если у вас есть яблоня, присмотритесь к ней внимательнее.
В обычном солодовом зерне крахмал распределяется примерно в следующих пропорциях: 20 % амилозы и 80 % амилопектина. Поскольку линейная α-1,4-структура амилозы уже присутствует в составе амилопектина, отдельно рассматривать амилозу дальше нет смысла. Поэтому в дальнейшем под крахмалом мы будем подразумевать прежде всего амилопектин.
На рисунке 3 показаны типы связей между молекулами глюкозы в крахмале — это α-1,4- и α-1,6-связи. Несмотря на то что у глюкозы шесть атомов углерода, в структуре крахмала используются только эти два типа связей.
Работа ферментов
Фух, самая скучная часть закончилась, и теперь перейдём к самому затиранию, а точнее — к ферментативному гидролизу крахмала.
В ферментативном расщеплении крахмала в пивоваренном солоде участвуют три основных фермента: это предельная декстриназа (LD), бета-амилаза (β) и альфа-амилаза (α).
В классических обучалках, посвящённых пивоварению, и на всевозможных интенсивах принято расписывать работу ферментов по температурным паузам примерно так: при 62 °C работает β‑амилаза, при 72 °C — α‑амилаза и так далее. Однако здесь нужно аккуратно обозначить действительное положение дел.
Для начала взглянем на одну типичную схему однопаузного затирания, где даже есть отсылки на классиков.
Глядя на такую картинку, можно подумать, что ферменты работают одновременно лишь в узком диапазоне температур, рекомендованном для однопаузного режима. Но это не так.
Ферменты — это не лампочки, которые включаются или выключаются при конкретной температуре. Они работают в широких диапазонах, пересекаются между собой и постепенно инактивируются.
И что интересно, они вообще не «включаются», если можно так выразиться. Они активны с самых низких температур, порядка 30–35 градусов. А вот инактивируются последовательно друг за другом и выходят на оптимум своей активности тоже последовательно. И этот оптимум — тоже не конкретная точка, а диапазон.
Бета- и Альфа-амилаза
В заторе это два брата-акробата, работа которых тесно связана. Поэтому для понимания осахаривания рассматривать их отдельно друг от друга практически бессмысленно.
Все вы знаете, что β‑амилаза отщипывает по два глюкозных остатка (мальтозу) с конца крахмальной цепи. Причём не просто с конца, а с нередуцирующего конца, на котором свободен C4.
И хочется спросить: а с какого перепугу она отщипывает только с нередуцирующего? Какая ей вообще разница?
И я имею вам что ответить на ваш вопрос. Давайте ещё раз взглянем на молекулу амилопектина со стрелками Мамазяна (Рисунок 3, б).
Как вы можете заметить, любая молекула амилопектина имеет лишь один свободный редуцирующий конец. Он как корень дерева или растения и обычно спрятан внутри ветвистой структуры, в то время как все остальные свободные концы молекулы именно нередуцирующие, и их десятки, сотни и тысячи. Я думаю, вопрос снимается.
Если есть у беты рот, значит, бета не урод.
Представьте себе инстадиву с большими силиконовыми губами. Она берёт в рот (прости хоспади) цепочку крахмала, фиксирует её кончиками губ примерно на уровне четвёртого глюкозного остатка, а зубами, расположенными глубоко во рту, начинает откусывать по два глюкозных остатка.
Далее она всасывает цепочку внутрь, пока не упрётся в «вилку», которая держит эту макаронину (крахмальную цепь). После чего выплёвывает огрызок в два-три глюкозных остатка, так как не может дотянуться зубами до вилки из-за своих огромных вареников.
И если вы думаете, что моя аналогия совсем из ряда вон, то сильно ошибаетесь. β‑амилаза — это как раз такой белковый клубок, своеобразный пакман с головой и щелью в виде рта, в которую крахмальная цепь входит с нередуцирующего конца.
Активный центр β‑амилазы связывает сразу несколько глюкозных остатков. Поэтому при приближении к точке ветвления объёмная структура амилопектина перестаёт помещаться в каталитическом кармане, и перед α-1,6-связью остаётся короткий нерасщеплённый огрызок.
Ещё одна интересная особенность β‑амилазы в том, что её этот рот заточен под нередуцирующий конец по принципу ключ — замок.
Простая гаражная аналогия
Представьте перфоратор и сверло для перфоратора. Вы можете засунуть сверло в патрон любой стороной. Но для того чтобы «работать», нужно засунуть сверло правильной стороной — хвостом. Тогда сверло жёстко зафиксируется, и можно будет сверлить бетон.
У фермента всё примерно так же. Он тратит какое-то время на захват конца, фиксирует его и начинает скользить по цепочке крахмала, совершая работу.
Альфа
На секунду представим, что при 62 градусах в нашем заторе работает только β‑амилаза.
Фермент сразу приступает к гидролизу свободных концов, но очень быстро упирается в 1,6-связи, которые он преодолеть не может. И в результате мы имеем огромную молекулу, запертую точками ветвления, и у β‑амилазы быстро заканчиваются доступные места для дальнейшей работы (Рисунок 5).
То есть если бы на паузе 62 °C α‑амилаза не работала вовсе, затирание было бы крайне затруднено. β‑амилаза обработала бы доступные концы амилопектина и длинные цепочки амилозы, после чего постепенно инактивировалась бы со временем. А оставшиеся крупные молекулы амилопектина расщеплялись бы уже позже, при более высокой температуре α‑амилазой, с образованием большого количества декстринов.
Но в реальности всё происходит иначе. α‑амилаза работает параллельно с β‑амилазой, просто медленнее и менее активно, чем в своём температурном оптимуме. По сути, она работает с ней в паре и в такт: разрезает цепи крахмала в случайных местах и создаёт для β‑амилазы новые точки входа.
Так о чём же на самом деле говорит эта картинка про однопаузное затирание? Она говорит о том, что при температуре ниже 65 °C скорость и надёжность полного осахаривания сильно зависят от солода, помола, pH и времени.
Поэтому температуру приходится поднимать в такой диапазон, где α‑амилаза работает значительно быстрее и способна к концу ваших полутора часов довести затор до нормального состояния, без синьки на йодной пробе.
И второй важный момент, который не понимают в основном новички, но его следует проговорить. Нередко можно встретить совет типа: "Для более тельного затирания нужно делать 72-ю паузу"
Более тельное затирание получается не потому, что «включилась α‑амилаза», а главным образом потому, что вклад β‑амилазы раньше проседает (β‑амилаза инактивируется), а α‑амилаза продолжает резать цепи, оставляя больше несбраживаемых фрагментов.
Предельная декстриназа (LD)
Хотелось бы обозначить ещё один интересный фермент — предельную декстриназу (LD).
Этот фермент способен отрывать ветки крахмала, разрывая α-1,6-связь в точке ветвления (Рисунок 6).
Вот что говорит про неё Кунце:
«В солоде, тем не менее, содержится фермент предельная декстриназа, способная растворять кроме 1,4-соединений также и 1,6-соединения, но при оптимальной для этого фермента температуре в 50–60 °C он едва ли имеет значение для процесса получения осахаренного затора. При 70 °C обнаруживается лишь слабая активность предельной декстриназы» [1, стр. 239].
Для тех, кто не понял, что имел в виду товарищ Кунце, я, пожалуй, переведу.
Работа ферментов возможна лишь в клейстеризованном крахмале. Температура клейстеризации для ячменного солода лежит в диапазоне 59–64 градусов Цельсия. Следовательно, фермент LD инактивируется раньше, чем происходит клейстеризация.
По лабораторным данным очищенная LD имеет оптимум при 50–55 градусах, выше которого резко инактивируется [3].
В более поздних исследованиях показано, что в солодовом сусле LD имеет более высокую термостабильность и при 62,5 градуса сохраняет активность (ВНИМАНИЕ!!!) в течение часа. А при 65 градусах теряет только 40 % активности. К тому же снижение pH с 5,7 до 5,4 способно пропушить активность LD на 40–70 % [3].
Главным грехом LD считалось его малое количество в сравнении с альфой и бетой, тем более что большая часть лимитдекстриназы в заторе находится в связанной с ингибитором (LDI) неактивной форме. Но, как оказалось, связанный фермент более термостабилен, и по ходу затирания он высвобождается и производит работу.
Ещё одним немаловажным фактором термостабильности LD является кальций [4]. Кальций препятствует проникновению молекул воды в гидрофобное ядро фермента, тем самым заметно повышая температурный порог, при котором белок начинает разрушаться.
Короче... Современные исследования показывают, что вклад LD в предельную сбраживаемость сусла долгое время недооценивался. Поэтому влияние низкого pH, кальция и некоторых других факторов, возможно, связано не только с работой β-амилазы, но и с гораздо более активной работой LD, чем считалось раньше.
И тут следует оговориться, что LD, его активность и термостабильность очень зависят от выращивания ячменя и соложения и не являются константой, как и амилазы.
Гидролиз
Пользуясь случаем, не могу не рассказать про гидролиз и почему он так называется.
Обратите внимание, что пока глюкозы находятся в цепи, они соединяются «общим» атомом кислорода, а после разрыва (гидролиза) на концах возникают OH-группы (Рисунок 7). То есть на одно расщепление жертвуется одна молекула H₂O.
Поэтому — нет воды, нет клейстеризации. Нет клейстеризации — нет расщепления, потому что нет воды.
Проблема расщепления декстринов β‑амилазой
β‑амилаза может расщеплять крахмальные цепи только с одной стороны — там, где свободен конец C4. При разрезании крахмальной цепи α‑амилазой образуется два конца — редуцирующий и нередуцирующий.
И на рисунке 8 ниже вы можете увидеть два декстрина, которые с виду очень похожи.
В первом случае длинная крахмальная цепь будет расщеплена бетой почти полностью, с остатком в две глюкозы и образованием предельного декстрина, а во втором случае декстрин останется практически нетронутым, так как с одной стороны он заперт 1,6-связью, а с другой — редуцирующим концом.
Интересно, правда? То есть длина предельного декстрина со стороны редуцирующего конца будет определяться только тем, насколько коротко его сможет подрезать α‑амилаза.
Что я не понимал?
Я не понимал, что такое редуцирующий конец.
В литературе принято изображать молекулы глюкозы в виде кружочков или шариков. И в большинстве случаев это нормальное и правильное дидактическое упрощение. Но не в случае объяснения ферментативных процессов, ибо геометрическое положение молекул глюкозы в пространстве крахмальной цепи имеет ключевое значение для понимания. И в этом вы только что могли убедиться.
Собственно, я предполагал, что редуцирующий конец — это конец, запертый 1,6-связью, а не вот это вот всё.
Ай да Кунце, ай да…
И вот спустя пару месяцев, когда все салфетки были изрисованы стрелочками, все вопросы отвечаны, а все непонятности стали понятны, я решил вернуться к старику Кунце и свежим просветлённым глазом прочитать раздел про затирание.
Открыл, начал читать, взглянул на картинку и прихирел:
Это чё за нах?
Как так-то?
Вы чё угараете, какие наркотики?
Мне опять всё заново начинать?
Что за две стрелки в разные стороны от разреза?
Тут я жёстко психанул и пошел жаловаться Дипсику. Обрисовал ему на словах картинку и то, что она противоречит теории и тексту в этом же разделе. Для тех, кто в танке, поясню, шо Дипсик — это бесплатный ИИ агент из поднебесной.
На мою претензию Дипсик ответил мне что-то типа: «Скорее всего, молодой человек, вы давеча огурцов объелись с парным молоком, ибо Кунце — это один из самых авторитетных источников, и там не может быть ошибки. Возможно…» и дальше начал мне лепить небылицы про упрощения и что это, возможно, показана работа глюкоамилазы и т. д. и т. п.
Проблема была в том, что Дипсик слепой, и ему приходилось долго и мучительно описывать изображение. И каждый раз он придумывал новые, всё более изощрённые и лженаучные доводы, которые я легко и просто разматывал на корню. В какой-то момент нашего спора я задал ему вопрос — сколько редуцирующих концов у предельного декстрина. Он долго рассуждал сам с собой и после ответил — три! Прочитав его «мысли», стало понятно, как он к этому пришёл - предельный декстрин не может быть гидролизован ни с одного конца, бета не ест с редуцирующего конца, всего концов три, значит правильный ответ - три. Сука, гениально.
Сразу после этого я приказал ему завалить хлебало и составить мне грамотное письмо на немецком языке с вопросом об этой картинке напрямую в VLB.
Это письмо мы писали целый день. Тщательно выверяли формулировки, сверяли картинки в разных изданиях. Больше всего я переживал за качество перевода. К слову, это было самое тактичное, выверенное и правильное с точки зрения этики и особенностей немецкого менталитета письмо, которое я когда-либо писал.
Честно — мне очень было важно, чтобы письмо было прочитано и на него было отвечено, и на это у меня была всего одна попытка, как мне тогда казалось.
Уже глубокой ночью я открыл почтовый ящик, вставил текст письма в сообщение, приложил заготовленные скриншоты и уже было хотел отправить… как в комнату ворвался Мамазян и таки внёс свою порцию троллинга в эту историю.
Буквально через пару минут после отправки я увидел уведомление о новом письме с адреса VLB.
Но это было лишь техническое письмо с информацией, что господин Олаф Хендель — это тот самый важный чел, на имя которого я отправил письмо... что господин Олаф Хендель ближайшие две недели в командировке и по срочным вопросам обращайтесь к его коллегам...
Короче, я понял, что раньше указанного срока моё письмо никто не прочитает, поэтому расслабил булку и успокоился.
Через пару недель ответное письмо застало меня в самый неподходящий момент. Оттянув шторку в смартфоне, я увидел уведомление от уже знакомого мне отправителя.
Внутри письма была не короткая отписка, а полноценный развёрнутый ответ. Я начал жадно рыскать взад-назад по тексту в поисках знакомых слов, но… немецкий… ска… Это вам не английский. В тексте не было ничего похожего на «ти мит цукер», «эншульдиган битте», «цайтунг», «бусхайтештеле», «зигинсвурдикайтн», короче ни одного слова, которое я проходил в дуолингво.
Закидывать письмо в Гугл-переводчик мне не хотелось, и я ломанул к своему соавтору. Он точно в курсе и сможет сделать мне добротный профессиональный перевод. Короче, закинул текст письма своему старому другу Дикпику, и вот что он мне выдал:
Уважаемый господин Мамазян,
Большое спасибо за ваше замечание. Я сначала был поражён, что вы ссылаетесь на русское издание 2009 года. У нас на других языках есть значительно более новые версии.
Однако упомянутая вами иллюстрация 3.32 остаётся неизменной с 3-го издания 1975 года и по сей день (за исключением того, что раньше она была чёрно-белой). И после того, как я внимательно изучил её в свете вашего возражения, я должен признать, что вы правы.
β‑амилаза атакует расщеплённые крахмальные цепи только с одной стороны, а не, как показано маленькими стрелками на рис. c), с обоих концов. В тексте, конечно, указано верно.
За последние 50 лет этого никто не заметил, или никто не указал на ошибку.
Поэтому я благодарю вас за это обоснованное замечание и внесу его в свой список исправлений для будущих изданий.
С наилучшими пожеланиями из Берлина, Олаф Хендель
Шатать-колотить… Папа внёс правки в Кунце!
Трындец, конечно. Круче уже не будет. Это вершина, это пик!! Можно смело продавать все свои кастрюли. Жизнь удалась нахой. И даже мой вечный ассистент Мариночка Альбертовна сказала, шо я таки молодец, но если вы, Ваня, такой умный, то где же ваши деньги?
И вот когда я стану старым, седым и красивым, вот тогда я буду внучикам прогонять телеги, как я со своим старым другом Олафом готовил к печати очередное издание Кунце.
Нужно ли говорить, что после такого письма я не спал полночи. Ворочался как червяк, и в полной тишине и темноте тихонько переживал свой маленький триумф. И раз за разом представлял, как мне вручают «Шнобелевскую премию по пивоварению».
И тут самый внимательный читатель задаст вопрос: «Так а шо там с карапилсами? Совать их в затор, чи не?» И к этому вопросу мы обязательно вернёмся, но немного позже, а сейчас самое время остановиться и немного отдохнуть.
Если вам понравилась моя история, то вы можете поставить лайк — это всего один клик. Перейти в телегу и поставить огонёчек — три клика. Написать в телеге поддерживающий комментарий — бесценно!!
A few years later…
… Вот таки дела, внучата. И тут я, значит, ему и говорю: «Олаф, ливерная ты колбаса, куда ж ты смотришь? Там твои художники все концы на картинке поперепутали…»…
[1] ТЕХНОЛОГИЯ СОЛОДА И ПИВА. В. КУНЦЕ (Перевод 9-го немецкого издания (2007 г.)
[2] https://cris.vtt.fi/en/publications/malt-limit-dextrinase-and-its-importance-in-brewing-dissertation
[3] https://themodernbrewhouse.com/wp-content/uploads/2016/11/Limit-Dextrinase.pdf
[4] https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7241666/pdf/fmolb-07-00051.pdf