Вводная

Органические примеси - невероятно, но это всё что не неорганическое и оказалось в финальном продукте. Ну химию в школе все проходили и органику от неорганики отличит каждый. А под продуктом в контексте данного опуса я буду подразумевать активную фармацевтическую субстанцию.

Если подходить формально, то определение примесей приводится в решении №138:

"Родственные примеси (родственные соединения)" (related substances) – органические примеси, родственные по структуре, целевому действующему веществу, включающие в себя промежуточные продукты, побочные продукты синтеза, продукты деградации (продукты разложения)

Когда речь идет о разработке химических процессов, то именно профиль родственных примесей является наиболее критическим показателям качества. С неорганикой и растворителями все достаточно просто и прямолинейно, их влияние на организм изучено вдоль и поперек. А вот различные родственные соединения которые могут влиять на фармакологические свойства надо охарактеризовать и понять их критичность.

Содержание любой примеси больше чем 0.1% относительно главной молекулы, должно быть обосновано. Содержание некоторых соединений ввиду своей особой активности (генотоксичности) ограничивается уже тысячными долями процентов (например 0.004%)

Это значит что целью разработки является не только эффективность химической схемы - сколько кг продукта будет получено на кг материалов, но и совокупное качество продукта.

Профиль примесей - вещь далеко не абстрактная, и в спецификациях выражается следующим образом:

• Содержание примеси (a,b, … y) - не более __ %
• Содержание единичной неидентифицированной примеси - не более __%
• Сумма неидентифицированных примесей – не более __%
• Сумма примесей – не более __%.

Пробелы мы обязательно заполним циферками, а пока разберем какой форточкой может надуть органические/родственные примеси в АФС. Я умышленно не буду касаться вопросов фармакологической активности этих примесей, чтобы не усложнять текущий текст, но обязательно расскажу как фарма отравляет наши жизни в сиквелах.

Общая схема

Вроде бы банально и просто из молекулы А, получаем молекулу Б.

Но, чтобы достигнуть желаемого результата, приходиться использовать еще различные растворители, про выбор которых я уже упоминал, и реагенты, начиная от обычной поваренной соли и заканчивая уже различными сложными катализаторами.

Конечно сам факт использования чистых веществ (95%+) на старте сильно упрощает задачу (тонкая промышленность же) и позволяет в свою очередь минимизировать побочные реакции, но абсолюта достигнуть невозможно, без недостатков не обойтись. Ну и конечно ничто не происходит из ничего, поэтому можно выделить типы тех самых органических примесей.

1. Исходные материалы (Starting materials)
2. Побочные продукты (By-products)
3. Промежуточные продукты (Intermediates)
4. Продукты деградации (API degradation)
5. Реактивы, лиганды и катализаторы (Reagents, ligands and catalysts)

Чтобы понять, что это лишь кусок айсберга головной боли привел схему, где я красным выделил все типы органических примесей о которых пойдет речь. Так в теме заявлена АФС, то про неё и напишу. ГЛФ разберу позднее.

I. Исходные материалы (starting materials)

Или кратко SM. Официально, материал, используемый при химическом синтезе АФС и, который включен в качестве основного конструкционного элемента в структуру промежуточного продукта и активной фармацевтической субстанции. Иными словами кубики "лего" для построения молекулы. Исходные материалы производятся серийно в промышленных масштабах и имеют установленные химические и физические свойства и структуру.

Что это значит конкретно - всё что мы не производим сами и закупаем для того, чтобы получить ту или иную молекулу при этом используемый реактив становиться частью финальной молекулы. Пример с Пазопанибом привожу ниже.

То есть стартовый материал это то с чего именно начинается синтез у нас на производстве. Можно подумать, что раз качество контролируется поставщиком материала, то и ответственность полностью лежит на третьем лице. Но к сожалению, во время разработки жизненно необходимо учитывать нюансы с качеством стартового материала.

Это как с продуктами, вы же не будете брать мясо для стейка где попало, вас будет интересовать, где корова росла, чем питалась и какую часть туши и когда вам отрезали. Со стартовыми материалами похожая история, они также синтезируются или добываются из природных ресурсов и нюансов хватает.

Выбор стратового материала не такая тривиальная речь как может показаться. В химическом фармацевтическом производстве есть категория non-GMP химических этапов. Когда синтез производится у вас, но не строго по правилам GMP (шок контент). Выбор GMP стартового материала (regulatory starting material) это отдельный холивар, который я тоже хотел бы отдельно осветить, но для затравки если интересно вот раздумывания ICH на эту тему.

Как выбирать поставщиков стартовых материалов

Что стоит учесть - если ваша схема синтеза сложна, витиевата и полна всякими каплингами (coupling reaction) то стоит не забывать про следующие аспекты.

1. Схема синтеза SM

Cтартовые материалы для стартовых материалов могут оставаться в схеме синтеза и тянуть за собой примеси до победного конца.

Например случай с Лесинурадом. После оптимизации схемы синтеза разработчики не без доли удивления обнаружили хлор содержащую примесь в своем продукте. Самое забавное, что в схеме нигде не использовался хлорирующий агент или даже намека на него.

Оказалось, что коммерческий, квалифицированный реагент NBS (кстати хорош тем, что не надо возиться с бромом) оказался загрязнен NCS.

Как так? Для синтеза NBS используется бром, который в свою очередь контаминируется хлором из-за специфики процесса производства брома из морской воды. Вот такая химическая матрешка, вылившаяся в головную боль разработчиков.

2. Неорганика

Также не забываем проверить использовались ли какие-то катализаторы для синтеза SM - остатки оксидов металлов могут ингибировать вашу целевую реакцию, особенно, если у вас тоже планируется использовать катализатор

Например (зачем вы вообще еще здесь) - случай, описанный при синтезе одного из полупродуктов. Проблемы были с реакцией Сузуки.

Что важно знать про реакцию - там используется [Pd] катализатор для того, чтобы реакция началась. Да самый настоящий и драгоценный палладий, который химики успешно превращают в 💩. Современная химия штука дорогая.

Так вот при попытке синтеза полупродукта, иногда реакция протекала как надо, а иногда тупо убивалась спустя пару часов.

Почему же так? Капризы? Нет, у химии нет эмоций и настроения. Оказалось, что в поставляемом продукте (слева) есть изрядная доля элементарной серы (прямиком из ада видимо). Откуда она там? Никто не знает и никогда не узнает, но сам факт попортил изрядно жизни производству и спустя пару кругов мытарств контроль серы более чувствительным методом ICP-OES появился в спецификации.

3. Растворители

Какими растворителями пользовались производители SM. Нет ли там чего-то особо токсичного, как бензол или хлороформ.

Очень важно в тех случаях когда стартовый материал используется на последних химических этапах и следовательно шанс подцепить не самые лучше растворители остается. Почему это важно - в документах ICH черным по белому есть список того, что использовать не стоит (растворители класса 1) при синтезе фармацевтических продуктов, но соблазн велик и нет гарантий что стартовый материал не утянет при себе какой-нибудь подарочек.

Предупрежден - вооружен. Не стоит полностью доверять качеству стартовых материалов и сертификатам анализа от производителя, даже если он трижды квалифицирован QA. Это слишком важно. К сожалению я встречался с ситуациями когда много месяцев разработки было потрачено зря , потому что “а чего его проверять, вроде по ВЭЖХ норм было”.

SM как органические примеси.

Это мы говорили про выбор стартовых материалов, перейдем к их роли как органические примеси. Сами по себе стартовые материалы (SM) это первые кандидаты на примеси в АФС. Почему так? Мы же вроде должны были их все “сработать” и превратить во что-то более стоящее. Как бы да и не совсем да.

Вспомимнаем такую штуку как “конверсию” - сколько исходного материала X превратилось в продукт Y. Да, превращения не всегда происходят как нам бы того хотелось и можно получить побочные продукты, но даже в этом случае достичь полной (100%) конверсии не получается.

Если визуализировать:

Вариант А - реакция “пятно в пятно”. 100% конверсия, 100% селективность.

Вариант Б - чистая реакция, но дожать не получается. 80% конверсия, селективность 100%. Такое иногда даже встречается в жизни.

Вариант С - классика. Реакция прошла, но не полностью, приправив реакционную массу доброй массой примесей. Конверсия также 80%, а селективность уже 75%. Печалька.

Реакции с полной конверсией и с 100% селективностью очень редки и скорее относятся к категории единорогов. В случае сложных химических превращений исходный продукт всегда остается в реакционной массе в количестве 1-20% от исходного количества.

Таким образом стартовые материалы становятся первыми очевидными кандидатами на органические примеси в АФС. Благо, что их содержание всегда легко проверить ввиду наличия значимых количеств веществ в лаборатории.

II. Реагенты, катализаторы, лиганды

Как и со Starting Material, крайне очевидная категория и родственная к предыдущей, но как-то повелось их выделять вот в отдельную страту из-за того, что если с изначальными материалами особо не поэкспериментируешь - молекулу надо из чего-то собирать, то с реагентами всегда есть возможность поиграться.

Самый банальный пример:

Амидный каплинг - популярная и в принципе единственный тип реакции при сборке пептидов. Конечно аминокислоты сами по себе не то, чтобы дружат в растворах. Рибосомы в раствор не засыпать, поэтому используются различные каплинг реагенты. На схеме ниже это вот DIC и HOBt. В целом этих реагентов десятки - вот отличнейший обзор. По ходу реакции и выделения с очисткой что-то может и будет оставаться в АФС, поэтому их наличие также будет в первую очередь проверяться регулятором.

Такой же подход применим ко всем кросс-каплинг реакциям, где используются весьма специфические лиганды и металл-содержащие катализаторы, которые уже являются источником элементных примесей. Но это совсем другая история.

Возвращаясь к “реагентам” - стратегия и общий подход такой же как со стартовыми материалами.

III. Побочные продукты (Side products)

И повысим ставки до максимума и вспомним про побочные продукты. Официального определения я не нашел, но опишу по своему. Это все продукты нецелевой конверсии реакции. Хотели получить продукт, а словили леща. В общем название говорит само за себя.

Кстати можно иногда столкнуться с недопониманием коллег при переводе - by-products и side product это не совсем одно и тоже. By-products - это побочные продукты, которые получаются в результате целевой реакции. Например при снятии BOC защиты вы получаете бонусом CO2 и t-BuOH. Это ожидалось и в итоге получили. Side products - это уже побочные продукты, которые получаются в результате побочной реакции, которую мы не приглашали в нашу колбу/реактор.

Конечно я должен сейчас начать приводить категории и причины протекания тех самых загадочных побочных реакций, но это как раз и является экспертной областью химика - предполагать, что может произойти в колбе. А значит, что мы тогда попытаемся запихать 5/8 лет учебы в пару абзацев. Звучит как великолепный план, надежный, как швейцарские часы, приступим.⚗️

Источники побочных примесей.

Реакция продуктов со стартовыми материалами

Самое простое и банальное. А + B → C, но еще параллельно может протекать реакции

А + A → D,

B + B → E,

C + A →F и т.д., вспоминаем комбинаторику.

Наглядно опять же приведу схему синтеза многострадального Пазопаниба:

Тут реакция между 5 и 6 приводит к продукту 7, но следом нам еще прилетает великолепный ремикс из 8, 9, 10 молекул.

То есть, во время планирования реакции/схемы синтеза учитывать все возможные функциональные группы (как например два хлора в молекуле 6), которые могут вступать в реакцию и быть готовым к не самому приятному результату. Жизнь - боль.

С этим можно работать используя защитные функциональные группировки, но если вы процессный химик, может оно того и не стоит - иногда лучше пожертвовать 10-20% материала, чем добавлять 2 этапа к схеме синтеза (постановка и снятие защитной группы).

Ожидаемые продукты реакции (by-products)

Это то что мы и так получим бонусом к целевому продукту, а-ля “all inclusive”. Актуально для реакций с длинным каталитическим циклом, где любой транзиентный интермедиат может привести к другому продукту.

Ожидаемые продукты реакции - результат нецелевой реакции, но ввиду особенности механизма, результат ожидаемый и пронозируемый.

Тут конечно вариантов слишком много и всё зависит от самой конкретной реакции и да даже химики не знат наизусть все механизмы. Но давайте вспомним одну из самых любимых реакций - Сузуки.

Сама реакции схематично выглядит так

Ну а если серьезно и по химически.

Выглядит здорово, но что может пойти не так?

Во-первых общая конверсия заочно лимитирована 70-80%. То есть в реакции всегда будет болтаться стартовый материал (обычно это тот, что с синеньким кружочком со схемы сверху)

Во-вторых есть дополнительные характерные продукты реакции. Продукт гомокаплинга (это не пропаганда если что) и продукт разложения бороновой кислоты.

То есть при постановке реакции Сузуки можно ожидать: целевой продукт (если повезет), побочные продукты, упомянутые выше, и остатки стартового материала.

И такой подход релевантен для всех типовых реакций в индустрии. Каждый пример рассматривается отдельно, не стоит ожидать от сложных химических превращений эффекта волшебной палочки. Вот еще пример механизма реакции окисления Сверна, где можно отхватить сульфидов в придачу к целевому продукту.

Просто побочные продукты (Side products)

Самая сложная, непредсказуемая категория. То что мы не ожидали увидеть, но оно все равно появляется так или иначе.

Скорее тут можно переформулировать - все до чего мы изначально не додумались + продукты реакционной деградации. Если накидывать источники

• Продукты избыточной реакции из-за избытка реагентов или передержки реакции. Реакционную деградацию отнесем туда же.
• Взаимодействие с растворителями или с примесями из них - самый банальный пример это антиоксиданты (BHT), не самый банальный это допустим остатки HCl в хлороформе.
• Взаимодействие с примесями из SM - про это упоминал сверху.
• Изомеризация в другой энантиомер/таутомер - не самое экзотичное превращение на самом деле.

В общем возможных вариантов десятки и приходится сопоставлять полученные m/z всех примесей с возможными гипотезами их образования.

IV. Промежуточные продукты (intermediates)

Чтобы понять что это можно обратиться опять к формальному определению - материал, полученный в процессе химического синтеза активной фармацевтической сумстанции, который подвергается дальнейшей химической трансформации, прежде чем становится активной фармацевтической субстанцией.

Чтобы избежать закидывания гнилыми помидорами при упоминании “интермедиатов” на великом и могучем. В РФ “интермедиатами” называются промежуточные продукты самой реакции, внутри колбы, которые обычно нестабильны и превращаются во что-то другое. В недружественных странах их называют reaction intermediate. А в РФ intermediate это “промежуточные продукты”.

В чем отличие от SM? В том, что мы их не покупаем, а синтезируем сами. Я уже приводил пример с пазопанибом из чего его получают, но теперь добавим в схему интермедиатов (полупродуктов). Выделим их отдельным цветом.

Особенностей тут немного, разве что весь химический коктейль который был наварен для получения промежуточного продукта с великой радостью переходит на следующий этап. Особо живучие примеси доходят до финального босса АФС, где уже приходится от них избавляться как от еретиков, жертвуя доброй часть продукта.

Ну и не безынтересный факт, предпоследний промежуточный продукт называют - penultimate intermediate и контроль его наличия в АФС является обязательным. Как минимум до инженерок.

V. Продукты деградации (degradation products)

Формально и по правде это те примеси, которые образовались во время изучения стабильности АФС или разработки аналитической методики. Закладывают субстанцию в камеру с определенными условиями (описанные в ICH Q1) и оценивают появляется ли в АФС что-то лишнее. Все новое - деградационные примеси (degradation-related), а всё что было изначально, после выделения АФС порошка - технологические (process-related).

Но есть нюанс (куда же без него) - промежуточные продукты (полупродукты), которые я упоминал раньше тоже не вечны и могут при хранении также разлагаться привнося свою долю экзотики. Производство не может взять и сразу запустить следующий этап.

Если эти деградационные примеси из полупродуктов доживут до конца химической цепочки, то с точки зрения финального продукта это будут все равно технологические примеси, но источник их происхождения будет как раз не совсем технологический.

Поэтому важно закладывать (не на районе в СПб, а в специальную камеру) на стабильность не только АФС, но и полупродукты. Эта стабильность обычно не показывается регулятору, но во время разработки всё-таки рекомендуется проверять живучесть всех полупродуктов. Хоть в сушильный шкаф засуньте на недельку и проверьте разницу до/после, производство и QA потом скажет спасибо.

Данный аспект крайне интересен и изучение путей деградации новых молекул требует вовлечения отдельных специалистов, которые очень хорошо разбираются в ВЭЖХ-МС/МС и могут предугадать варианты деградации молекулы. Если без глубоких подробностей, то молекула может подвергаться:

• Гидролизу - самое банальное, вода есть всегда и везде, а некоторые соединения просто норовят развалиться в её присутствии
• Окислению - кислород не только медленно убивает нас всех, но и портит жизнь разработчикам. Если в молекуле АФС есть свободный азот или сера, всегда можно ожидать примесей - оксидов.
• Фотолизу - свет сам по себе является источником энергии и может инициировать различные побочные реакции.

Последним рубежом проверки стабильности АФС всегда является разработка аналитического метода, где все эти деградационные факторы изучаются для того чтобы удостовериться что метод работает нормально. Все таки в хроматографической колонке не самые приятные условия для стабильной жизни молекулы, нигде нельзя расслабиться.

Но это слишком поздно, чем раньше процессный химик начнет копаться в возможных путях деградациях молекулы тем лучше. И да, если у вас воспроизведенная субстанция с монографией (дженерик) то можно выдохнуть, за вас уже подумали и в монографии все требования уже имеются. Хотя и с дженериками тоже есть особенности, но и так уже бошка кипит наверное, пока не будем об этом.

И не отметить я не могу, что деградационные примеси из АФС также возникают от воздействия:

• Первичной упаковки - в пленках, пакетах и ведрах содержаться фталаты, альдегиды, которые могут вступать в реакцию с АФС, поэтому выбор первичной упаковки крайне важен. Да чем раньше будет информация о финальной упаковке тем лучше.
• Микробиологической контаминации - бактерии тоже живые и хотят кушать, поэтому если АФС съедобна, то почему нет. Так что несоблюдении требований по асептике чревато отдельным биокаталитическими реакциями в пакете с субстанций, со всеми вытекающими

Понимание профиля деградационных примесей очень важно, так как они определяют срок годности или ре-теста субстанции. При этом всё лишнее, что образовалось во время хранения не должно оказывать влияния на пациента. Халява это хорошо, но не всегда полезно.

Поэтому регулятор очень внимательно относится к исследованиям стабильности субстанции и готовой формы, чтобы не дай здравый смысл там появилось что-то новое и неизведанное.

Профиль примесей

Пробежавшись по всему этому химическому богатству возникает резонный вопрос, связанный с тем, а как это вообще все можно ужать во что-то более менее простое и понятное.

Конечно во время разработки процесса количество возможных примесей может исчисляться десятками, но после масштабирования и характеризации финального процесса, остаются только самые живучие гады, которые в спецификации выражаются как я писал до этого.

Добавим на этот раз цифры:

• Содержание примеси (a,b, … y) - не более 0.1 или 0.15 % или как пойдет😐
• Содержание единичной неидентифицированной примеси - не более 0.1%
• Сумма неидентифицированных примесей – не более 0.5% или тоже как пойдет
• Сумма примесей – не более 0.8 или 1.0% хотя тут тоже как получится.

Все цифры с требованиями не берутся с потолка, а являются как раз результатом in vivo исследований, где возможная фармакологическая активность родственных органических соединений отдельно изучается, поэтому и появляется оговорка “как пойдет”.

Кстати примеси, перечисленные в спецификациях, это только верхушка айсберга. В досье их количество больше, но с обоснованиями почему они не попали в спецификацию. С монографиями разговор другой, если она имеется то можно её воспринимать как ТЗ, но не без учёта особенностей выбранной схемы синтеза.

Есть соблазн назвать как раз такого рода требования “профилем примесей”, но это лишь его малая часть и общую картину “профиля примесей” надо представлять с учётом неорганики и растворителей. Думаю в этом тексте и так хватает сложностей и оставлю это на следующий лонгрид.

Summary

Как обещал - сосредоточился только на органических примесях тянущихся из субстанции (АФС). Пока я не трогал растворители и элементные примеси, и всякого рода сюрпризов с этапов формуляции, но и до них очередь дойдет.

При системном подходе (ниже бонус-пример) разобраться и охарактеризовать все возможные органические примеси не составляет труда. Без химической экспертизы не обойтись - пока нет хемоинформатических инструментов, которые бы смогли бы подсказать чего стоит ожидать, но я знаю, что некоторые мастодонты работают над этим, так что может в будущем жить станет легче.

Что дальше? Чтобы разобрать поднятую тему то стоит ожидать лонгриды на следующие темы:

• Рассмотрю откуда берутся цифры в спецификациях, что такое эти ваши % в АФС/ГЛФ
• Методы контроля органических примесей, не ВЭЖХ единым.
• Ну и профиль примесей собственно, какие есть подходы к систематизации органического зоопарка.
• Закусим примесями из ГЛФ.
• И напоследок отдельно пройдусь по генотоксичным примесям, уж очень люблю их

Бонус: алгоритм характеризации орг. примесей

‼️Сугубо практически-химический контент. Прочтение данного раздела может нанести непоправимый ущерб ментальному здоровью.

А теперь перейдем к разряду - “непрошенные советы”. Допустим вы процессный химик, как не упустить неуловимую примесь и охарактеризовать полученную АФС:

1. Сразу бежим закладывать АФС на стресс-стабильность. Потом пригодится. Можно пока без ICH.
2. Проверяем имеющуюся аналитическую информацию о АФС после синтеза - аналитический метод скорее всего еще не валидированный и попросту платформенный, поэтому уточняем пределы чувствительности (LOD, LOQ, S/N, вот это всё)
3. Составляем список всего что нашлось помимо самой субстанции. Не забываем что фигни в бланке тоже хватает.
4. Собираем информацию о стартовых материалах и интермедиатах. Проверяем их наличие. Если нет ВЭЖХ-МС, то прокалываем образцы со стандартами.
5. Проверяем что осталось неидентифицированного. Чекаем АФС с деградации и сравниваем профили. Сразу можно вычесть примеси деградации (degradation related impurities)
6. Оставшиеся неиндентифицированные пики (точеные видимо) это как раз побочные продукты реакции, надо выяснить их происхождение. Прокалываем все интермедиаты (полупродукты) из схемы и сравниваем профили. Если есть совпадение, то можно выдвинуть гипотезу, что эта примесь тянется именно из промежуточного продукта.
7. Ну и самое интересное - расписываем все возможные побочные реакции и сравниваем m/z примеси с вашими гипотезами. Без ВЭЖХ-МС уже не обойтись конечно. Для полноценной идентификации лучше использоваться MS высокого разрешения.
8. Если же m/z никак не совпадает - в ход идет тяжелая артиллерия. Встречный синтез. Анализируем при каких условиях содержание искомой примеси увеличивается и повторяем эти условия (повышение темпратуры, времени выдержки и т.д.), выделяем примесь с помощью флэш-хроматографии и анализируем с помощью ЯМР (2D в помощь).
9. Вы прекрасны, все примеси идентифицированы. Можно теперь готовиться к новым вызовам на этапе формуляции.😁

GL HF