Хранение дрожжей. Заморозка

Изложенный далее текст является продолжением статьи «Хранение дрожжей». В целом всё по старому, плюс поднакопились экспериментальные данные которые я решил собрать в кучку.

Сухари

С сухарями все стабильно. Морозилка и точка. Стартер заводиться мгновенно на просрочке в 3-5 лет.

Уклоны

Уклоны очень и очень хороший способ хранения дрожжей. Четырехлетний уклон при самом наплевательском отношении к хранению дал хорошие всходы на чашке. Осадок тех же дрожжей, хранившейся в схожих условиях был абсолютно мертв. Выросла лишь одна колония и та не дрожжевая.

Для выявления расхождений с оригинальной культурой в следствии возможных мутаций при хранении я сделал сплит брожение дрожжи с уклона и сухарями (читать тут). Разница между образцами была минимальной, и с какой-то стороны дрожжи с уклона выглядели интересней сухарей. Делаем поправку на то, что испытуемый штамм US-05 устойчив к высушиванию и возможно в этом и кроется секрет долголетия.

Для надёжности следует руководствоваться советами профессионалов и пересаживать дрожжи хотя бы раз в год, заполняя пробирки маслом.

Писибаночки. Осадок под слоем пива.

Есть у меня подопытная банка с дрожжей W68. В прошлом году я наудачу решил разбродить с неё одну пробирку и дрожжи завелись, хотя на тот момент банка простояла уже больше года в холодильнике. Я решил оставить её родимую и раз в год смотреть как дела, все ли там живы-здоровы.

В этом году для наглядности я сделал посев на чашку. Отобрал петлёй жирную каплю суспензию и размазал по чашке. Два дня чашка молчала. На третьи сутки дрожжи стали проклевываться.

Собственно, невооруженным глазом видно, что культура находится в плачевном состоянии. Никакого сплошного роста. Общее количество колоний чуть больше сотни. Большое количество петит колоний.

Наглядно убедившись в надежности уклонов я решил навести порядок в своём холодильнике. Рассеял штаммы по чашкам, и пересадил их на уклоны. Всякий неликвид выбросил без зазрения совести.

При всей простоте и надежности уклонов есть в них один большой минус. И минус этот скорее психологический. Каждый раз при отборе материала начинается паранойя: «А не занёс ли чего в пробирку?» Десятки раз убедившись, что я всё делаю правильно и чисто (но это не точно), эти мысли всё равно не отпускают и являются неким блоком. Естественно у меня есть дублирующие уклоны в которые я не лазаю, но всё же…

Отсюда постоянное желание найти какой-то более подходящий форм-фактор хранения, который бы удовлетворял следующим требованиям:

1. Дрожжи должны быть расфасованы под одну варку / один стартер. Не важно, будет там миллиард клеток или миллион, главное чтоб не было возможности контаминировать всю культуру целиком.
2. Должны долго храниться. Варю я не часто и некоторые штаммы могут не использоваться по году.
3. Занимать мало места.

Ну… губа не дура. Под такой списочек может подойти только заморозка небольшими порциями.

Хранение в морозилке

На заре своего увлечения пивоварением я уже пробовал морозить дрожжи в шприцах. Как итог - одна запоротая варка, еще одна запоротая варка у знакомого, с кем я по доброте душевной поделился «чистой» дрожжевой культурой)). На каком именно этапе я накосячил сейчас и не скажу, наверно на всех.

Главной проблемой (лично для меня) в заморозке дрожжей является асептика при смешивании дрожжевой суспензии с криопротектором и дальнейшее наполнение резервуаров хранения, и виной всему воздух. Объясню на пальцах:

В случае пересева из чашки в пробирку можно минимизировать влияние воздуха простыми действиями - крышка чашки не открывается полностью, а лишь приподнимается под улгом, как бы защищая зонтиком поверхность чашки. Пробирка тоже держится под очень острым углом к горизонту, тем самым сводя к минимуму попадание частиц внутрь из воздуха. Добавляем сюда горелку и прокаленную петлю, и имеем возможность работать чисто даже в «грязном» помещении.

В очередной раз отбирая дрожжи с уклона я решил, что настало время снова попробовать чего-нибудь заморозить.

Инструкция по заморозке от Уайта.

Кристиан Белый всё доступно изложил в разделе о культивации дрожжей. Ниже приведу полный текст «рецепта» [1, стр. 156]:

Процедуры для хранения при -20 оС.

1. Выберите культуру и выращивайте её в 10 миллилитрах среды в течение 48 часов. Рост происходит до этого времени, но дрожжи накапливают запасы гликогена после роста.
2. Переместите 10-миллилитровую культуру в температуру 4 оС (40 oF) и
   выдержите ещё 48 часов, чтобы стимулировать выработку трегалозу
   дрожжами.
3. Под пламенем горелки повторно встряхните 10-миллилитровую пробирку и перенесите 1 мл в стерильную микроцентрифужную пробирку на 1.5 мл. Наклейте на пробирку название, номер и дату штамма.
4. Центрифугируйте пробирки в течение 3-4 минут. Осторожно снимите и поместите их в штатив под пламя горелки.
5. Осторожно слейте жидкость, сохранив дрожжевой осадок на дне.
6. Приготовьте раствор из 50% глицерина и 50% YPD.
7. Добавьте в раствор 1 грамм аскорбиновой кислоты на литр.
8. Добавьте 1 мл раствора в пробирку с дрожжами и осторожно перемешайте стерильной пипеткой.
9. Плотно закройте, оберните парафильмом, поместите пробирки вертикально в небольшой ящик из пенополистирола и затем поместите контейнер в морозильную камеру.
10. Чтобы оживить дрожжи, либо выберите часть культуры пипеткой и поместите её на чашку Петри, либо нагрейте всю пробирку рукой, пока она не станет комнатной температуры, а затем добавьте её в 100 мл жидкой питательной среды.

Итак, вроде всё понятно. Но есть определенные ограничения в оборудовании и ингредиентах.

YPD - это среда для культивирования дрожжей и грибов. В ее составе - дрожжевой автолизат, пептон, декстроза. По всей видимости она является источником питательных веществ для клеток в случае разморозки.

В продаже я смог найти только YPD с агором, «по запросу», за дорого, и сразу килограмм. Поэтому решил, что буду использовать обычное пивоваренное сусло с нутриентами. По хорошему, сусло - отличный субстрат для культивирования грибов.

Вторым камнем преткновения стала центрифуга. Её у меня нет и покупать её я не планирую. Да и без неё можно обойтись немного изменив техпроцесс.

Крис предлагает повторно встряхнуть пробирку после двух суток пребывания в холодильнике для того, чтобы в минипробирку попал не только осадок, но и плохо фокулирующие дрожжи, которые могут остаться в «отработке». И уже в минипробирке осаждать полностью все клетки при помощи центрифуги.

Слишком ранний съём дрожжей с отработанного сусла, от дрожжей выборочно отбрасываются из популяции дрожжи с низкой флокуляцией и дрожжи с высокой аттенюацией. У вас может получиться осадок дрожжей, который не полностью выбродит пиво. Дайте стартеру завершить цикл брожения перед декантированием.

А может всё намного проще и подобная манипуляция служит для удобного и равномерного фасования осадка. И скорее всего это главная причина. Ну как ещё по другому? Петлей там что ли ковырять? Короче, этот этап мы исключаем.

Сделав небольшой расчет получаем, что на 1 мл стартера нам нужен 1 мл криопротектора. Отсюда можно вывести вот такую стратегию действий -

• делаем стартер, скажем, 200 мл двое суток.
• Затем 2 суток в холодильнике дрожжи накапливают гликоген и трегалозу и попутно отстаиваются.
• Готовим 200 мл криопротектора глицерин/сусло - 50/50 плюс 0,2 грамма аскорбинки, автоклавируем.
• Автоклавируем микропробирки, и другие приборы.
• Вблизи горелки декантируем стартер и вливаем в него криопротектор, перемешиваем.
• Вблизи горелки шприцем наполняем пробирки, закрываем, подписываем и морозим.

Вроде уже ближе к нашим реалиям...

Механической пипетки у меня тоже нет, поэтому решил использовать старый советский стеклянный шприц. За один раз им можно заполнить 10 пробирок. Можно наверное и обычный одноразовый использовать, но мне показалось, что у советских игла намного толще и будет удобнее в него набирать густую жижу. «Фильм готов, осталось его снять» (с) какой-то режиссёр.

Попытка №1. Или как всё запороть

Для реализации задуманного выписал пробирки, штатив для автоклавирования и штатив для хранения в морозилке.

Дальше дело не хитрое. Сделал стартер на 200 мл, покрутил 2 денька, потом в холодильнике дал 2 дня постоять.

Так как пробирки «открытые» завернул их в фольгу прям в штативе и отправил в автоклав вместе с шприцами.

Раствор глицерин/сусло так же отправил автоклавироваться. Глицерин у меня был в наличии, но если кто хочет купить в аптеке, то нужно внимательно смотреть не упаковку. Чаще всего у аптечного глицерина под надписью глицерин есть приписка «глицерол». Это означает что он разбавленный до 85+- процентов. Искать нужно 99,5% , либо разводить по схеме глицерол/сусло - 85/15, и использовать сусло или YPD тройной концентрации.

Стартер я аккуратно декантировал и влил в него криопротектор. Тщательное всё перемешав принялся фасовать. И тут началось.

В своем идеальном мирке я предполагал, что буду держать колбу под наклоном одной рукой, а второй рукой буду наполнять шприц... но не тут то было. Густая суспензия наотрез отказалась набираться в шприц и мне пришлось таки поставить колбу на стол и набирать шприц двумя руками.

Далее дело дошло до пробирок. Оказалось, что достать пробирку из штатива одной рукой, тем более левой, не так-то просто. Одна пробирка пулей выскочила и покатилась по столу. Вторая цеплялась крышкой за крышки соседних пробирок и тоже норовила куда-то улететь. В результате я психанул и снял фольгу полностью, чтоб она не мешала. И даже это не помогло нормально их доставать. Я то и дело касался пальцами то внутренней части крышки, то горла пробирки. Осознав, что дело дрянь я спокойно заполнил пробирки как получается, закрыл подписал и убрал в морозилку.

Эти 8 пробирок я сохраню для дальнейшего наблюдения, но сбраживать на них я ничего не буду.

Приняв двепонольпять успокоительного я снова открыл Криса Уайта, нашёл раздел про заморозку дрожжей, и отмотав страницу назад увидел таки список необходимого оборудования, где русским по белому написано: «Стерильные микропробирки или микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой»… с завинчивающейся крышкой, Карл!!! Для тупых!!! Написано!!!

Короче, граждане, пробирки с причпокивающейся крышкой НЕ БЕРËМ.

Продолжив листать учебники я вдруг осознал, что помимо пробирок я накашлял ещё несколько ошибок при подготовке культуры.

Теория

Изучая опыт заморозки дрожжей на различных форумах и чатах неоднократно натыкался на очень скромные сроки хранения в 3-6 месяцев. При этом Уайт указывает надежный срок хранения в 0-2 года, а выживаемость культуры в целом более пяти лет.

Интересно, что указано именно 0-2 года, а не просто 2. То есть дрожжи могут отправиться к праотцам уже при попытке охлаждении до -20 градусов. И причин тому несколько:

Во-первых вода при замерзании кристаллизуется и может наделать дырок в стенках мембраны дрожжевой клетки. Во-вторых холод вымораживает воду из клеток и вслед за ней может происходить утечка из клеток резервных питательных веществ, в результате чего при реак­тивации "высушенных" клеток происходит заметное снижение их жизнеспо­собности [2, стр. 320]

Во избежание пагубного влияния холода дрожжевую суспензию смешивают с криопротектором, который защищает клетки от образования кристаллов льда и система сохраняет некоторую гибкость в стеклообразной фазе, таким образом, ведя себя как аморфное твердое тело. Речь здесь идет о хранении в жидком азоте при температуре -134 градуса.

Помимо криопротектора есть ещё один важный параметр для успешной реактивами дрожжей после заморозки - хорошее физиологическое состояние культуры перед заморозкой.

Чем лучше состояние дрожжей было до заморозки, тем лучше их состояние будет при оттаивании. Соберите дрожжи для хранения из чистого лабораторного разведения. Нужно использовать дрожжи, которые находятся на пике здоровья, с большим запасом гликогена и трегалозы. Фактически, способность клеток переносить замораживание коррелирует с уровнем гликогена и клеточной трегалозы. [1, стр 154]

Гликоген - это своего рода жирок у дрожжей, запас питательных веществ. После пробуждения клетка не начинает сразу метаболировать, а занимается настройкой внутренних процессов, синтезом стерина для восстановления мембраны и уже после переходит к потреблению. Для всего этого ей нужен хороший запас гликогена как внутреннего источника резервного питания.

Убедитесь, что дрожжи полностью осели, прежде чем декантировать отработанное сусло. Хранение дрожжей в том же сосуде в течение дополнительных восьми-двенадцати часов после того, как они выбродили все сахара в стартере, позволяет им накапливать запасы гликогена. [1, стр 108]

Ближе к концу брожения дрожжи пытаются накопить запас гликогена, чтобы сохранить его в предстоящие голодные времена и использовать в качестве энергии для будущего размножения и брожения. Когда дрожжи хранятся, они медленно расходуют свои запасы гликогена, чтобы остаться в живых. Недостаток гликогена ослабляет их клеточные стенки и делает их более восприимчивыми к разрушению. [1, стр 125]

На графике выше пунктирной линией (2) обозначено содержание в клетке гликогена. Максимальный пик приходится на завершающей стадии брожения (в стационарной фазе), тогда как во время фазы логарифмического роста он расходуется.

Максимальное образование гликогена достигается:

1. при высокой концентрации сахара (плотное сусло, глубокое сбраживание);
2. низких температурах брожения;
3. в результате технологического подавления размножения дрожжей. [2, стр.69]

И, пожалуй, самое главное:

При интенсивном размножении в условиях сильной аэрации дрожжи «не успе­вают» синтезировать гликоген. [2, стр.69]

Трегалоза - ещё один резервный углевод позволяющий клеткам справляться со стрессами. В нашем случае это температурный шок который испытывает клетка при оттаивании. Трегалоза участвует в реакциях обмена веществ при стрессе, обеспечивая устойчивость к температуре и недостатку влаги, придаёт клеткам свойство восстановления после длительного высушенного состояния.

В отличие от гликогена роль трегалозы, как резервного вещества, подвергается сомнению, так как в отсутствие углерода и азота она не метаболизируется. Однако неоспорима ее роль в лагфазе роста дрожжей. При наличии в среде необходимых для размножения субстратов трегалоза потребляется за 45 мин, после чего начинает утилизироваться глюкоза.

Синтез гликогена и трегалозы активизируется при переходе культуры из логарифмической скорости роста в фазу замедления роста, т.е. во время снижения удельной скорости роста дрожжей. [3]

Кроме того, большие количества трегалозы образуются под действием других стрессовых факторов, например, в присутствии ядовитых для дрожжей химических соединений (этанола, меди, сульфата), а также в условиях окислительного стресса (Н2О2). Следует отметить, что в высокоплотном сусле (более 12%) дрожжи активно син­тезируют трегалозу [2, стр. 72]

Работа над ошибками

В процессе подготовки культуры для длительного хранения не нужно использовать мешалку, а тем более с принудительной подачей воздуха через аэрационный камень. Мешалка, за счет масса и газообмена хороша для наработки биомассы непосредственно перед брожением пива.

В нашем же случае предпочтительным является анаэробный рост дрожжей, то есть обычное брожение. 10-и миллилитровая пробирка, предлагаемая Уайтом, как раз-таки подразумевает именно брожение. Периодическое встряхивание позволяет отвести углекислоту, что способствует росту биомассы и ускорению сбраживания, но не аэрирует сусло.

Второй момент - плотность сусла. По традиции я приготовил сусло 7-9 плато, как делаю обычно для стартера. За двое суток на мешалке он выбраживает полностью. Следуя данным, указанным выше целесообразно готовить сусло повышенной плотности - в районе 12 плато.

Не думаю, что мешалка и низкоплотное сусло смогут критически повлиять на жизнеспособность дрожжей, однако... Лично у меня появилось больше понимания того, что именно подразумевает Уайт в своей инструкции.

Предполагаемый мной процесс фасовки тоже оказался «так себе». Из приготовленной мной суспензии в 200 мл у меня осталось 190 мл которые только утилизировать. Такой объем я делал для удобства взвешивания аскорбинки, хотя этот ингредиент не является критически важным.

Сразу выливать оставшуюся суспензию я не стал. Взял свои самые обычные 10 мл пробирки в количестве двух штук, в одну задал 5 мл суспензии и стал пробовать переливать ее из одной в другую. Изговнякал весь стол, но раз на десятый стало получатся аккуратно переливать содержимое из одной в другую. Нужно руку набить. Однако приходится смыкать горла пробирок, что не есть хорошо. Нужны пробирки с более широким горлом, тогда всё будет по феншую.

Наполнять микропробирки из стеклянной тоже получается, но опять таки со смыканием горловин. То есть после первой микропробирки все последующие будут с измазанной горловиной. Микропробирки пластиковые и обжечь над горелкой их нельзя. Соответственно, такой вариант не подходит и нужно искать хорошую пипетку. Шприц мне не зашел, но как вариант можно держать в уме.

Порывшись в закромах отыскал пару бесхозных пробирок на 25 мл. Набрал в одну 10 мл суспензии и со второго раза я лил точно из одной в другую без смыкания горловин. Главное лить уверенно. Берём!

Осталось обзавестись годными пипетками и можно пробовать снова.

Хранение под слоем воды

Еще из интересного у Уайта вычитал вот чего:

Хранение в стерильной дистиллированной воде переводит дрожжи в состояние покоя, и некоторые отчёты предполагают, что дрожжи могут храниться таким образом в течение многих лет без охлаждения. [1, стр. 154]

Процедура:

1. Добавьте 2-3 миллилитра дистиллированной воды в пробирку с завинчивающейся крышкой и стерилизуйте в автоклаве или скороварке. Перед использованием охладите до комнатной температуры.
2. С помощью стерильной петли перенесите колонию из чашки в воду. Нужно небольшое количество дрожжей, размером со спичечную головку. Старайтесь не зацепить твёрдую среду под колонией.
3. Плотно закройте пробирку. Если крышка не имеет прокладки, оберните пробирку виниловой лентой или всю пробирку парафильмом для герметизации.
4. Можно хранить эти пробирки при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, хотя охлаждение может продлить срок хранения.

Решил сделать закладку(в парадной под поребриком) и в таком формате. Автоклав, пробирка на 10 мл с дистиллятом, мини пробирки, шприц и все готово. В качестве донора использовал чашку с уже упомянутым многострадальным штаммом W68. Отбирал «спичечную головку» с первых попавшихся колоний и отправлял их в пробирки. Буду хранить их на стеллажи и тоже наблюдать за их состоянием. Вообще мне слабо верится, что это надежный способ хранения.

Первые результаты

Приехал журналист-колхозник к чукчам и говорит: - Узнали мы, что у вас есть новый метод выращивания картофеля. - Да есть - ответили чукчи - с утра сажаем, а вечером уже выкапываем. - Что? Так быстро растет? - Неее... очень кушать хочется.

Не прошло и недели, как руки снова зачесались. Достав одну пробирку из морозилки обнаружил что жижа не замерзла. При этом дрожжи таки опустились в конус. Тщательно взболтав пробирку сделал посев на чашку.

Уже на первые сутки дрожжи проклюнулись, а на вторые показали хороший ровный рост.

Буквально за минуту пробирка нагрелась от моих пальцев до комнатной температуры. Видимо придется городить какой-то аккумулятор холода, а так не хотелось раздувать размеры бокса.

Резюме

Не смотря на такую фиаску с пробирками категорически заявляю: начало длительного и интересного наблюдения за одноклеточными таки положено. Дрожжи, как минимум удачно перенесли заморозку.

Будем посмотреть, как говориться. Со своей стороны ещё подумаю как можно правильно работать с такими пробирками. Конечно, завинчивающаяся крышка сильно облегчила бы задачу. К тому же она обеспечит лучшую герметизацию и предотвратит вымораживание воды из суспензии и впоследствии из клеток.

Да и шприц совсем не подходящий инструмент для подобных процедур. То ли дело механическая пипетка. Возможно когда нибудь дорасту и до пипетки, и до ламинарного шкапика. А пока изучаю предложение по объективному контролю за жизнеспособностью дрожжей (микроскоп высматриваю, но это т-с-с-с).

А на сегодня всё. И да, если вам понравился выпуск, то можете в телеграм канале распочать бутылочку шампаньскага в честь @frendfrekenbok. Именно этот прекрасный дон проспонсировал покупку этих злосчастных пробирок, а значит и этот выпуск)).

Источники информации:

[1] Yeast : the practical guide to beer fermentation/ Chris White, Jamil Zainasheff

[2] Дрожжи в пивоварении/Г. Аннемюллер, Г.-Й. Мангер, П. Литц

[3] Особенности метаболизма трегалозы у пивных дрожжей низового брожения/ Т.В. Меледина, С.А. Черепанов